本文關(guān)鍵詞：造血干細(xì)胞和單核細(xì)胞來源的樹突狀細(xì)胞在形態(tài)、表型及功能的對(duì)照實(shí)驗(yàn)研究

  更多相關(guān)文章： DC疫苗 臍帶血 CD34+造血干細(xì)胞 抗原提呈 CTL 超微結(jié)構(gòu)

【摘要】：目的:本實(shí)驗(yàn)旨在探討臍帶血CD34+造血干細(xì)胞來源的樹突狀細(xì)胞(CD34-DC)與外周血單核細(xì)胞來源的樹突狀細(xì)胞(Mo-DC)在細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞表型、誘導(dǎo)生成的CTL細(xì)胞毒性方面的差異,并探討不同來源的DC超微結(jié)構(gòu)的變化與其抗原處理與抗原提呈功能之間的相關(guān)性,以期制備功能更加強(qiáng)大的DC疫苗。方法:取健康成人外周血,采用密度梯度離心法獲取單核細(xì)胞后誘導(dǎo)生成DC(Mo-DC);取健康足月產(chǎn)孕婦臍帶血,采用磁珠分選法分離純化CD34+造血干細(xì)胞,并培養(yǎng)于含粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞刺激因子(GM-CSF)/干細(xì)胞因子(SCF)的培養(yǎng)基誘導(dǎo)CD34+造血干細(xì)胞擴(kuò)增及DC前體細(xì)胞的生成,GM-CSF/白細(xì)胞介素-4(IL-4)培養(yǎng)基進(jìn)一步誘導(dǎo)前體細(xì)胞向DC細(xì)胞的分化(CD34-DC)。電鏡下觀察CD34-DC及Mo-DC的形態(tài),比較其細(xì)胞突起數(shù)量、細(xì)胞核大小及內(nèi)體小泡數(shù)量;流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同培養(yǎng)時(shí)間(d1,d3,d5,d7)的CD34-DC及Mo-DC表面分子表達(dá),并給予FITC-OVA257 264沖擊,培養(yǎng)24小時(shí)后檢測(cè)其抗原提呈能力;取培養(yǎng)至d5的CD34-DC及Mo-DC均負(fù)載CEA蛋白并加入腫瘤壞死因子(TNF-α)制備成CEA特異性的CD34-m DC、Mo-m DC(即DC疫苗),分別體外誘導(dǎo)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)生成,并利用MTS法檢測(cè)其各自對(duì)CEA高表達(dá)的腫瘤細(xì)胞系Ls174-T的細(xì)胞毒性,以檢測(cè)其激活T細(xì)胞的功能。結(jié)果:1光學(xué)倒置顯微鏡觀察兩種細(xì)胞來源的d0,d3,d7的CD34-DC、Mo-DC及負(fù)抗原后DC疫苗的形態(tài)學(xué)變化。D0時(shí)細(xì)胞均為圓形或橢圓形,且在細(xì)胞膜表面有微小突起,d3兩種來源的DC均表現(xiàn)出樹突狀,Mo-DC突起較少且細(xì)長(zhǎng),呈梭形,而CD34-DC突起較多且粗短,d7 Mo-DC突起更加明顯,且筆直,窄并伴以針尖狀尾部,但CD34-DC突起相對(duì)較短且部分突起分叉,細(xì)胞膜粗糙不規(guī)整。整體來看,CD34-DC的突起形成比Mo-DC早。經(jīng)過細(xì)胞因子和腫瘤抗原刺激之后的DC,懸浮生長(zhǎng)而失去樹突狀外觀,表現(xiàn)為類圓形,細(xì)胞膜清晰且光滑。2電鏡觀察CD34-DC、Mo-DC超微結(jié)構(gòu)變化分別觀察d3、d5、d7的CD34-DC、Mo-DC樹突狀突起數(shù)量、細(xì)胞核大小及內(nèi)體小泡數(shù)量。CD34-DC的突起數(shù)量在d5上升、d7下降,而Mo-DCs的突起數(shù)量d3-d7是逐漸減少的。CD34-DC細(xì)胞核直徑于d3、d5、d7分別為5.2±0.3、6.54±0.4、7.34±0.3,而Mo-DC為5.1±0.2、5.2±0.4、5.46±0.4,結(jié)果表明,培養(yǎng)7天后,CD34-DC細(xì)胞核比Mo-DC大(P0.05)。CD34-DC的胞漿內(nèi)體小泡數(shù)量于d3、d5、d7分別為29.74±3.23、31.73±4.2、38.24±2.5,Mo-DC分別為:26.28±3.2、24.55±3.7、22.68±2.9,結(jié)果表明,培養(yǎng)7天后,CD34-DC的胞漿內(nèi)體小泡數(shù)量比Mo-DC多(P0.05)。上述結(jié)果表明,與抗原提呈能力密切相關(guān)的內(nèi)體小泡數(shù)量在CD34-DC中多于Mo-DC。3流式細(xì)胞儀檢測(cè)不同來源的DC表面分子CD80、CD83、CD86表達(dá)率。Mo-DC表面CD80的表達(dá)率于d1-d7都極低,而CD83、CD86的表達(dá)率呈逐漸升高趨勢(shì),在經(jīng)腫瘤抗原及促成熟細(xì)胞因子刺激生成Mo-m DC后三種分子均可迅速升高。CD34-DC表面CD80、CD83、CD86的表達(dá)率于d1-d7均呈逐漸升高趨勢(shì),經(jīng)腫瘤抗原及細(xì)胞因子刺激生成CD34-m DC后表達(dá)率亦可迅速升高。Mo-m DC與CD34-m DC相比,三種表面分子表達(dá)率均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05,P0.05,P0.05),說明Mo-DC與CD34-DC經(jīng)抗原及細(xì)胞因子刺激生成的Mo-m DC與CD34-m DC均可成熟。4取培養(yǎng)d1、d3、d5、d7的CD34-DC、Mo-m DC,分別用FITC標(biāo)記的OVA257-264沖擊后,用流式細(xì)胞儀檢測(cè)其在不同時(shí)間的抗原提呈能力。D1,CD34-DC中陽性細(xì)胞率為15.27%±1.47,Mo-DC只有5.16%±1.00。在d3、d5、d7,兩種DC陽性細(xì)胞率均呈上升趨勢(shì),d7時(shí),CD34-DC的陽性細(xì)胞表達(dá)率達(dá)到81.8%±1.5,而Mo-DC只有57.2%±1.4,CD34-DC較Mo-DC上升更加明顯(P0.05),說明CD34-DC比Mo-DC具有更強(qiáng)的抗原提呈能力。5 MTS法檢測(cè)DCs刺激同種異體T淋巴細(xì)胞的增殖能力。取兩種來源的未成熟DCs按1:1分別與T淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)4天,結(jié)果顯示,以無DC刺激的T細(xì)胞作為對(duì)照,經(jīng)CD34-DC刺激后T淋巴細(xì)胞增值率為208±39%,Mo-DC增值率為156±48%。兩者無顯著性差異(P0.05)。說明CD34-DC與Mo-DC在刺激同種異體T淋巴細(xì)胞的增殖能力方面無差異。6負(fù)載CEA生成的CD34-m DC與Mo-m DC疫苗分別激活的CTL對(duì)CEA高表達(dá)的Ls174-T腫瘤細(xì)胞的殺傷效率對(duì)比。CEA特異性CD34-m DC激活的CTLs(CC-CTLs)在效靶比為10:1、50:1、100:1時(shí)對(duì)LS174-T的殺傷率分別為63.3±1.52%、80.6±2.51%、90±2.0%。CEA特異性Mo-m DC疫苗誘導(dǎo)激活的CTLs(CM-CTLs)對(duì)LS174-T殺傷率分別為35±2.64%、53.6±3.21%、68.6±3.51%。結(jié)果顯示,CC-CTLs及CM-CTLs都可以殺傷CEA高表達(dá)的腫瘤細(xì)胞Ls174-T,但CC-CTLs比CM-CTLs有更高的殺傷率(P0.05)。結(jié)論:1經(jīng)GM-CSF/SCF培養(yǎng)基可誘導(dǎo)臍帶血CD34+造血干細(xì)胞擴(kuò)增及生成DC前體細(xì)胞,并在培養(yǎng)d8開始貼壁生長(zhǎng),每3天可收獲一批DC前體細(xì)胞,用GM-CSF/IL-4培養(yǎng)基可進(jìn)一步誘導(dǎo)生成CD34-DC,其表型與Mo-DC無差異。2臍血造血干細(xì)胞來源的CD34-DC具有更強(qiáng)的抗原提呈、促淋巴細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)激活CTL的能力。3電鏡下樹突狀突起數(shù)量、細(xì)胞核大小及內(nèi)體小泡數(shù)量的變化是評(píng)估DCs功能差異的微觀機(jī)制。4臍帶血來源的CD34-DC有望成為制備DC疫苗新的、理想的原料細(xì)胞。
【關(guān)鍵詞】：DC疫苗 臍帶血 CD34+造血干細(xì)胞 抗原提呈 CTL 超微結(jié)構(gòu)
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R392
【目錄】：

• 中文摘要4-7
• 英文摘要7-11
• 英文詞縮略表11-12
• 前言12-13
• 材料與方法13-20
• 結(jié)果20-24
• 附圖24-31
• 附表31-34
• 討論34-36
• 結(jié)論36
• 參考文獻(xiàn)36-39
• 綜述 腫瘤免疫治療的最前線—樹突狀細(xì)胞疫苗39-49
• 參考文獻(xiàn)44-49
• 致謝49-50
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷50

【相似文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 陳東明,鮑衛(wèi)漢,王琦,徐少駿,唐巖;樹突狀細(xì)胞在異常瘢痕中的免疫調(diào)控作用[J];中華整形外科雜志;2001年05期

2 王明軍;樹突狀細(xì)胞的形成、功能及可能的應(yīng)用[J];國外醫(yī)學(xué)(免疫學(xué)分冊(cè));2001年04期

3 戴盛明,楊春旭;樹突狀細(xì)胞異質(zhì)性研究進(jìn)展[J];國外醫(yī)學(xué)(生理、病理科學(xué)與臨床分冊(cè));2001年04期

4 龔樂羅 ,蘇建中 ,馮久賢;肺癌患者外周血樹突狀細(xì)胞的體外擴(kuò)增及生物學(xué)特性的觀察[J];中國煤炭工業(yè)醫(yī)學(xué)雜志;2001年10期

5 時(shí)宏珍,戚春建,朱一蓓,席泓,古濤,時(shí)文彪,張學(xué)光;重組人可溶性CD40配體對(duì)樹突狀細(xì)胞體外分化、成熟及功能的影響[J];上海免疫學(xué)雜志;2002年02期

6 周燕瓊,劉小輝;樹突狀細(xì)胞的分離擴(kuò)增與培養(yǎng)技術(shù)研究進(jìn)展[J];解剖學(xué)研究;2002年03期

7 史敦云,汪明春;樹突狀細(xì)胞功能亞群及其調(diào)節(jié)因子的研究進(jìn)展[J];深圳中西醫(yī)結(jié)合雜志;2002年05期

8 王全楚,馮志華;樹突狀細(xì)胞基礎(chǔ)研究及其在免疫治療中的作用[J];世界最新醫(yī)學(xué)信息文摘;2002年06期

9 姚莉,梁曉俐;樹突狀細(xì)胞的凋亡與調(diào)控[J];免疫學(xué)雜志;2003年S1期

10 孟哲峰;樹突狀細(xì)胞來源的趨化因子的免疫調(diào)節(jié)作用研究進(jìn)展[J];國外醫(yī)學(xué).臨床生物化學(xué)與檢驗(yàn)學(xué)分冊(cè);2004年01期

中國重要會(huì)議論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 王濤;杜智;朱爭(zhēng)艷;;樹突狀細(xì)胞瘤苗的研究進(jìn)展(綜述)[A];天津市生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)會(huì)第29屆學(xué)術(shù)年會(huì)暨首屆生物醫(yī)學(xué)工程前沿科學(xué)研討會(huì)論文集[C];2009年

2 潘建平;張明徽;倪衛(wèi)琴;王青青;夏大靜;張立煌;余海;曹雪濤;;γ—干擾素在樹突狀細(xì)胞表型和功能成熟中的作用[A];中國免疫學(xué)會(huì)第四屆學(xué)術(shù)大會(huì)會(huì)議議程及論文摘要集[C];2002年

3 翁霞;鄧曉輝;馬靜秋;余金妹;梁輝;;不同來源樹突狀細(xì)胞的培養(yǎng)研究[A];第三屆全國血液免疫學(xué)學(xué)術(shù)大會(huì)論文集[C];2003年

4 成翔;汪曉鶯;季玉紅;韓毓;吳瓊;;β-1,4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶-Ⅰ在樹突狀細(xì)胞中的表達(dá)及對(duì)其功能的影響[A];中國免疫學(xué)會(huì)第五屆全國代表大會(huì)暨學(xué)術(shù)會(huì)議論文摘要[C];2006年

5 劉曉霞;陳育民;;體外誘導(dǎo)生成樹突狀細(xì)胞成熟度和激活性的調(diào)控[A];中國免疫學(xué)會(huì)第五屆全國代表大會(huì)暨學(xué)術(shù)會(huì)議論文摘要[C];2006年

6 包晶晶;林海霞;馬t，

本文編號(hào)：588887