發(fā)布時(shí)間：2017-06-02 03:02

  本文關(guān)鍵詞：腸出血型大腸埃希菌O157:H7 espF基因結(jié)構(gòu)域缺失株的構(gòu)建及功能研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：一、研究背景和目的腸出血型大腸埃希菌(Enterohemorrhagic Escherichia coli, EHEC)是大腸埃希菌的一個(gè)亞型,有100余種血清型,其中0157：H7是EHEC中引起危害最大的病原菌。EHEC O157:H7通過糞-口途徑傳播,主要寄居于牛、羊等反芻動(dòng)物體內(nèi),是一種食源性人畜共患腸道致病菌。同其他EHEC血清型主要引起感染性腹瀉不同,EHEC O157:H7能夠引起出血性結(jié)腸炎(Hemorrhagic colitis, HC)、溶血性尿毒綜合癥(Haemolytic uraemic syndrome, HUS)和血栓性血小板減少性紫癜(thrombotic thromobocytopenic purpura, TTP)等疾病。1982年,美國(guó)學(xué)者Riley等首次在嚴(yán)重出血性腹瀉患者糞便中分離出EHEC O157:H7。此后,世界范圍內(nèi)不斷有EHEC O157:H7引起的散發(fā)病例和小型暴發(fā)。1996年5-8月,日本大阪Sakai市發(fā)生了一起涉及40余縣市的EHEC O157:H7暴發(fā)流行,累計(jì)感染者9000余名,造成11人死亡。2000年,加拿大Ontario市Walkerton區(qū)發(fā)生一起EHEC O157:H7暴發(fā),累計(jì)患者5000余名,造成5人死亡,據(jù)報(bào)道,暴發(fā)是由Walkerton區(qū)供水系統(tǒng)受污染引起。1986年,我國(guó)首次從出血性結(jié)腸炎患者中分離到EHEC O157:H7,此后全國(guó)多地有小規(guī)模爆發(fā)流行。1999-2000年,我國(guó)蘇皖等地發(fā)生了一起大規(guī)模EHEC O157:H7暴發(fā)流行,患者約2萬(wàn)余人,死亡177人,流行長(zhǎng)達(dá)7個(gè)月,可能是迄今為止EHEC O157:H7世界范圍內(nèi)流行規(guī)模最大、死亡人數(shù)最多、流行時(shí)間最長(zhǎng)、發(fā)病原因最復(fù)雜的一次。目前,EHEC O157:H7的暴發(fā)流行仍時(shí)有發(fā)生,總體流行呈上升趨勢(shì),且具有較強(qiáng)的致病性和致死性,對(duì)人類健康構(gòu)成極大威脅,是全球性的公共衛(wèi)生問題。EHEC O157:H7的致病作用主要體現(xiàn)在兩方面：分泌志賀樣毒素(Shiga toxin, Stx)和細(xì)菌對(duì)腸黏膜上皮細(xì)胞造成黏附-抹去損傷(Attaching and effacing Lesion, A/E損傷)。EHEC O157:H7分泌的志賀樣毒素分Stx1和Stx2兩型,可導(dǎo)致Vero細(xì)胞病變,因此也稱Vero毒素。EHEC O157:H7細(xì)菌進(jìn)入人體腸道后,緊密黏附于腸黏膜上皮細(xì)胞,使腸黏膜上皮細(xì)胞骨架重排、細(xì)胞間緊密連接破壞、腸微絨毛肌動(dòng)蛋白去聚化,導(dǎo)致微絨毛收縮和脫落,造成A/E損傷。引起A/E損傷的主要毒力基因位于EHEC染色體腸細(xì)胞脫落位點(diǎn)(Locus of enterocyte effacement, LEE)毒力島,LEE毒力島由LEE1-LEE5五個(gè)操縱子組成,編碼多種重要毒力因子。EspF基因位于LEE4末端,編碼分泌效應(yīng)蛋白EspF (EHEC-secreted protein F),其在分泌效應(yīng)蛋白中作用范圍最廣、功能最多。關(guān)于致病型大腸埃希菌(Enteropathogenic Escherichia coli, EPEC)的研究表明,細(xì)菌通過Ⅲ型分泌系統(tǒng)(Type three secretion system, TTSS)將EspF蛋白注射至腸黏膜上皮細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)后,EspF蛋白可與宿主細(xì)胞內(nèi)多種蛋白分子作用,造成宿主細(xì)胞核仁、線粒體、中間絲狀體破壞,微絨毛抹去,細(xì)胞間緊密連接破壞,細(xì)胞膜重建,細(xì)胞骨架重排,墊狀結(jié)構(gòu)(Pedestal formation)形成,最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。EspF蛋白與A/E損傷致病菌的致病機(jī)制密切相關(guān),學(xué)術(shù)界稱EspF為A/E損傷致病菌致病作用的“瑞士軍刀”經(jīng)生物信息學(xué)分析,EHEC 0157:H7 EspF蛋白N端(1-73aa)包含一個(gè)分泌信號(hào)(1-20aa)、一個(gè)宿主細(xì)胞線粒體結(jié)合信號(hào)區(qū)域(Mitochondrial targeting signal, MTS, 1-24aa),一個(gè)核仁結(jié)合域(Nucleolar targeting domain, NTD,21-74aa)。C端(73-248aa)由4個(gè)PRR組成,各個(gè)PRR之間高度同源,各自包含一個(gè)真核細(xì)胞SNX9 (Sorting nexin 9)蛋白結(jié)合位點(diǎn)SH3(Srchomology3)基序,一個(gè)N-WASP (Neuronal Wiskott-aldrich syndrome protein)結(jié)合域,一個(gè)可能的肌動(dòng)蛋白結(jié)合基序(Actin binding motif, ABM)EHEC O157:H7 EspF蛋白N端的MTS位點(diǎn)能夠靶向結(jié)合宿主細(xì)胞線粒體,研究表明,如果將MTS的第16位亮氨酸突變?yōu)楣劝彼?EspF蛋白不能結(jié)合到線粒體,用自殺質(zhì)粒將N端包括MTS位點(diǎn)的部分基因敲除后,細(xì)菌對(duì)細(xì)胞的黏附能力和介導(dǎo)細(xì)胞凋亡能力下降。C端4個(gè)PRR均含有SH3結(jié)合基序PxxP,能特異結(jié)合宿主細(xì)胞含SH3結(jié)合域的蛋白,如SNX9蛋白,其含有三個(gè)保守區(qū)域SH3、PX和BAR,SH3由50-60個(gè)氨基酸組成,主要識(shí)別富含脯氨酸序列PxxP模塊的細(xì)胞信號(hào)蛋白(如Src和Abl酪氨酸激酶蛋白家族),介導(dǎo)蛋白-蛋白的相互作用。SNX9蛋白是一個(gè)細(xì)胞內(nèi)膜調(diào)控子,可引起膜小管形成,誘導(dǎo)細(xì)胞膜重建,促進(jìn)細(xì)菌的侵襲。目前,國(guó)內(nèi)外對(duì)EPEC的EspF蛋白功能進(jìn)行了較為深入的研究,但對(duì)EHEC的EspF蛋白功能研究較少,其與腸上皮細(xì)胞內(nèi)蛋白相互作用、誘導(dǎo)腸上皮細(xì)胞凋亡的機(jī)制以及EspF蛋白各個(gè)功能域的作用仍不明確。本課題組在前期工作中構(gòu)建了EHEC O157:H7espF基因N端缺失株,證明大腸桿菌0157：H7EspF蛋白N端能靶向結(jié)合線粒體,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。而EspF蛋白C端PRR區(qū)能與宿主細(xì)胞中SNX9等蛋白通過其SH3結(jié)合域結(jié)合,在細(xì)胞內(nèi)形成了一個(gè)復(fù)雜而龐大的蛋白與蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò),并與細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路和細(xì)胞凋亡存在某種聯(lián)系。那么這些蛋白是怎樣協(xié)同作用啟動(dòng)或介導(dǎo)了細(xì)胞凋亡呢?是否與出血性腸炎有關(guān)呢?仍有待于進(jìn)一步研究。根據(jù)EspF蛋白的結(jié)構(gòu)研究,本研究從EspF的N端結(jié)構(gòu)域與C端PRR結(jié)構(gòu)域入手,利用λ Red重組系統(tǒng)構(gòu)建了3株EHEC O157:H7 EDL933w菌株的基因缺失株：espF基因缺失株(EHEC O157:H7 EDL933w △espF)、espF基因N端缺失株(EHEC O157:H7 EDL933w △espF-N)和espF基因C端缺失株(EHEC O157:H7 EDL933w AespF-C),同時(shí)構(gòu)建各自的回補(bǔ)株,研究比較野生株、缺失株與回補(bǔ)株的生物學(xué)差異、對(duì)宿主細(xì)胞的黏附力差異及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的能力差異,初步研究了各功能域?qū)?xì)菌毒力的影響及相關(guān)功能。二、研究方法1、EHEC O157:H7 espF基因結(jié)構(gòu)域缺失株與回補(bǔ)株的構(gòu)建(1)缺失株的構(gòu)建根據(jù)GenBank的espF基因序歹(Accession NO. NC_02655)及其上、下游的DNA序列,設(shè)計(jì)合成兩對(duì)含同源臂引物:H1K1、H2K2和H3K3、H4K4。H1K1與H2K2用于構(gòu)建espF基因敲除株打靶片段,H3K3與H2K2用于構(gòu)建espF基因N端敲除株打靶片段,H1K1與H4K4用于構(gòu)建espF基因C端敲除株打靶片段。這4條引物5’端為與待敲除區(qū)域基因上下游50bp同源的同源臂,用于擴(kuò)增打靶片段兩端的同源臂,3’端與卡那霉素抗性基因部分序列同源,用于擴(kuò)增打靶片段中央的卡那霉素抗性基因。以含卡那霉素抗性基因的質(zhì)粒pKD4為模板,分別以H1K1與H2K2、H3K3與H2K2、H1K1與H4K4為引物PCR擴(kuò)增,得到espF基因卡那霉素抗性打靶片段、espF-N基因卡那霉素抗性打靶片段、espF-C基因卡那霉素抗性打靶片段。將打靶片段電擊轉(zhuǎn)化進(jìn)入含有pKD46質(zhì)粒的EHEC O157:H7 EDL933w菌株中,利用L-阿拉伯糖誘導(dǎo)pKD46質(zhì)粒表達(dá)重組酶,利用λRed同源重組系統(tǒng),卡那霉素抗性片段的卡那霉素抗性基因替換待敲除的espF、espF-N、espF-C基因。利用卡那霉素篩選出陽(yáng)性重組菌,設(shè)計(jì)兩對(duì)引物F1、R2和F2、R1,其中F1、R2位于espF基因上下游,F2、R1位于卡那霉素抗性基因上,通過交叉引物PCR及測(cè)序,驗(yàn)證陽(yáng)性菌是否發(fā)生了同源重組。(2)回補(bǔ)株的構(gòu)建根據(jù)GenBank的espF基因序列(Accession NO. NC_02655)設(shè)計(jì)兩對(duì)引物：Fc、Rn和Fn、Re。引物Fc與Rn擴(kuò)增espF基因片段,引物Fn與Rn擴(kuò)增espF-N基因片段,引物Fc與Rc擴(kuò)增espF-C端基因片段。將PCR擴(kuò)增片段切膠純化,與載體pGEM-T easy進(jìn)行連接反應(yīng)后,轉(zhuǎn)化于大腸桿菌DH5α,利用氨芐霉素篩選陽(yáng)性菌,PCR并測(cè)序,得到完成連接的DH5 α pGEM-espF、 DH5α pGEM-espF-N, DH5α PGEM-espF-C菌株。培養(yǎng)提取質(zhì)粒后分別電擊轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)入相應(yīng)基因缺失株△espF、△espF-N、△espF-C.氨芐霉素篩選陽(yáng)性菌,提取質(zhì)粒,以Fc、Fn、Rc、Rn為引物PCR并測(cè)序驗(yàn)證回補(bǔ)質(zhì)粒已轉(zhuǎn)入缺失株,成功構(gòu)建回補(bǔ)株。2、野生株與突變株生物學(xué)特征的比較野生株和突變株經(jīng)涂片-干燥-固定后進(jìn)行革蘭染色：初染-媒染-脫色-復(fù)染,光學(xué)顯微鏡觀察。在相同培養(yǎng)條件下,在0、1.5、3、4、6、8、10、12、14、16、20 h分別測(cè)定野生株和突變株的OD600值,以時(shí)間為橫坐標(biāo),OD600的對(duì)數(shù)值為縱坐標(biāo),繪制各菌株的生長(zhǎng)曲線。3、細(xì)菌黏附實(shí)驗(yàn)(1)吉姆薩(Giemsa)染色觀察細(xì)菌黏附結(jié)腸癌細(xì)胞Lovo于6孔板培養(yǎng)至單層后,分別用相同濃度EHEC O157:H7野生株和突變株感染細(xì)胞2小時(shí),按吉姆薩染色步驟處理：涂片-固定-染色-洗脫。在光學(xué)顯微鏡下觀察野生株和突變株對(duì)Lovo細(xì)胞的黏附情況。(2)涂板計(jì)算細(xì)菌黏附率過夜培養(yǎng)的野生株、espF缺失株(△espF)、N端缺失株(△espF-N)、C端缺失株(△espF-C)、和陰性對(duì)照菌(DH5α)共5株,重懸于不含抗生素的培養(yǎng)基(DMEM,10%胎牛血清),重懸后細(xì)菌的濃度均為2×107/mL。 Lovo細(xì)胞培養(yǎng)于12孔板內(nèi),長(zhǎng)至單層細(xì)胞(約2×105　cells/孔)。以每孔2×107的細(xì)菌量接種到培養(yǎng)Lovo細(xì)胞的12孔板內(nèi)(細(xì)胞感染倍數(shù)100：1),輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)板混勻。細(xì)胞培養(yǎng)板放入培養(yǎng)箱,37℃,5%C02,培養(yǎng)1.5-2h。每種細(xì)菌接種4個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)后細(xì)胞用PBS洗3次,加入150μl的0.5%　Triton X-100裂解細(xì)胞,孵育8min后,加入100μl　PBS,反復(fù)吹打吸出樣品,每孔樣品分別10-2、10-3、10-4梯度稀釋后涂布于同一塊瓊脂平板上均勻分布的三區(qū)中,每區(qū)加稀釋后的菌液20uL,輕柔地對(duì)平板進(jìn)行傾斜旋轉(zhuǎn),使得各區(qū)菌液面積均勻擴(kuò)大但不得超過分區(qū)的劃線。24小時(shí)后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù),計(jì)算黏附率(黏附率=黏附到細(xì)胞的細(xì)菌數(shù)/初始加到細(xì)胞孔的總細(xì)菌數(shù)×1000‰)。用SPSs13.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(One Way ANOVA),比較各菌株黏附率平均值的差異。三、結(jié)果1、構(gòu)建了三株EHEC O157:H7 EDL933w espF基因缺失株：espF基因缺失株(△espF)、N端缺失株(△espF-N)、C端缺失株(△espF-C),并構(gòu)建了各自的基因回補(bǔ)株用引物H1-K1與H2-K2、H3K3與H2K2、H1K1與H4K4,分別PCR擴(kuò)增出卡那霉素抗性打靶片段,大小為1576bp,分別電擊轉(zhuǎn)化于含有質(zhì)粒pKD46的EHEC O157:H7 EDL933w感受態(tài)細(xì)胞中。用含kana的LB固體培養(yǎng)基篩選得到陽(yáng)性菌,增菌后,用卡那霉素基因內(nèi)部鑒定引物PCR電泳驗(yàn)證,發(fā)現(xiàn)野生株中無(wú)目的條帶,缺失株中可見到一條大小為471bp的片段。測(cè)序證實(shí),菌株EHEC O157:H7 espF基因(747bp)、espF-N基因(219)和espF-C基因(528)完全缺失。用引物Fc與Rn、Fn與Rn、Fc與Rc,分別PCR擴(kuò)增出回補(bǔ)片段,大小分別為747bp、219bp、528bp,經(jīng)瓊脂糖電泳,切膠純化回收后,與載體pGEM-T easy于4℃連接12h后轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細(xì)胞DH5 α中,用氨芐霉素LB固體培養(yǎng)基篩選陽(yáng)性菌,將篩選到的陽(yáng)性菌提取質(zhì)粒后用通用引物M13 PCR并測(cè)序。根據(jù)測(cè)序結(jié)果確定含有正確重組載體的陽(yáng)性菌,將其擴(kuò)大培養(yǎng)后提取質(zhì)粒,分別電擊轉(zhuǎn)化入相應(yīng)的基因缺失株△espF、△espF-N、△espF-C,成功構(gòu)建了基因回補(bǔ)株。2、野生株與缺失株生物學(xué)特征比較結(jié)果經(jīng)革蘭染色可見,野生株和三株突變株均為革蘭染色陰性,短小棒狀桿菌。根據(jù)所測(cè)的OD600繪制生長(zhǎng)曲線,野生株和突變株的生長(zhǎng)曲線趨勢(shì)基本一致。3、細(xì)菌黏附實(shí)驗(yàn)吉姆薩染色可見野生株黏附于細(xì)胞的數(shù)量較多,突變株較少,黏附數(shù)：野生株多于突變株多于DH5 α。涂板后計(jì)數(shù)菌落,計(jì)算細(xì)菌的黏附率,數(shù)據(jù)經(jīng)單因素方差分析,結(jié)果顯示,野生株與突變株間的黏附率比較P0.01,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。野生株的平均黏附率是13.879±3.578‰,突變株△espF的平均黏附率是6.401±1.519‰,突變株△espF-N的平均黏附率是5.402±3.212‰,突變株△espF-C的平均黏附率是4.795±1.950‰,DH5 α平均黏附率是0。四、結(jié)論1.利用λRed同源重組系統(tǒng),成功構(gòu)建了EHEC 0157:H7 EDL933w espF缺失株(△espF).N端缺失株(△espF-N.)和C端缺失株(△espF-C),并成功構(gòu)建了espF基因回補(bǔ)株、N端回補(bǔ)株和C端回補(bǔ)株。為今后EHEC 0157:H7 EspF蛋白的功能研究打下了基礎(chǔ)。2.espF基因及結(jié)構(gòu)域基因的缺失不影響EHEC 0157:H7的形態(tài)與生長(zhǎng)規(guī)律。3espF基因及結(jié)構(gòu)域基因的缺失降低了EHEC 0157:H7對(duì)腸黏膜上皮細(xì)胞的黏附力,黏附力：野生株高于突變株,突變株高于DH5α。
【關(guān)鍵詞】：腸出血型大腸埃希菌O157:H7 espF基因 λRed同源重組系統(tǒng) 黏附-抹去 (A/E)損傷
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R378
【目錄】：

• 摘要3-9
• ABSTRACT9-17
• 前言17-25
• 1 腸出血型大腸埃希菌O157:H7的流行病學(xué)17-18
• 2 腸出血型大腸埃希菌O157:H7的致病機(jī)制18-20
• 3 分泌蛋白EspF的結(jié)構(gòu)與功能20-23
• 4 EspF研究中的問題與本論文研究宗旨23-25
• 第一章 EHEC O157:H7 espF基因結(jié)構(gòu)域缺失株與回補(bǔ)株的構(gòu)建25-45
• 1.1 材料25-28
• 1.2 方法28-37
• 1.3 結(jié)果37-43
• 1.4 討論43-45
• 第二章 EHEC O157:H7基因缺失株生物學(xué)特性初步研究45-54
• 2.1 材料45-46
• 2.2 方法46-48
• 2.3 結(jié)果48-52
• 2.4 討論52-54
• 全文總結(jié)54-57
• 參考文獻(xiàn)57-63
• 附錄 英文縮略詞表63-64
• 碩士期間完成的論文64-65
• 致謝65-66

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前3條

1 陸獻(xiàn)耀;陸群英;占利;余樟有;金莞爾;尹志英;楊瑞軍;;浙江省衢州市柯城區(qū)檢出帶毒力基因的腸出血性大腸埃希菌O157:H7[J];疾病監(jiān)測(cè);2008年10期

2 倪大新,汪華,顧玲,郭喜玲,莊菱,施平,潘浩,史智揚(yáng),胡曉抒,劉光中;江蘇省1999年大腸埃希菌O157∶H7宿主動(dòng)物帶菌情況調(diào)查[J];中華流行病學(xué)雜志;2002年02期

3 肖成蕊,劉和平,王振國(guó),王偉利,魏柏友,張輝;吉林省雞肉中O-157:H7埃希氏大腸桿菌的檢出狀況[J];中國(guó)動(dòng)物檢疫;2004年04期

  本文關(guān)鍵詞：腸出血型大腸埃希菌O157:H7 espF基因結(jié)構(gòu)域缺失株的構(gòu)建及功能研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：414061