目的建立Koutango病毒(KOUTV)的實(shí)時(shí)熒光定量TaqMan反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)檢測(cè)方法。方法從GenBank中下載KOUTV基因序列,進(jìn)行多序列比對(duì)分析,針對(duì)NS5基因中的高保守序列片段設(shè)計(jì)KOUTV的特異引物與探針,用4科9種病毒進(jìn)行檢測(cè)方法特異性驗(yàn)證,通過(guò)平行重復(fù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證檢測(cè)方法穩(wěn)定性,利用體外轉(zhuǎn)錄的RNA標(biāo)準(zhǔn)品建立了KOUTV的NS5基因拷貝數(shù)的絕對(duì)定量分析模型。結(jié)果引物與探針工作特異性良好,同一樣品重復(fù)檢測(cè)循環(huán)閾值(Ct)的變異系數(shù)均小于1.5%,定量分析模型靈敏度達(dá)到1.0×10²拷貝/反應(yīng)。通過(guò)本研究建立的快速檢測(cè)方法對(duì)新疆采集的112批,6 328只蚊蟲進(jìn)行了測(cè)定,結(jié)果均為陰性。結(jié)論成功建立了KOUTV的高特異性、高敏感性的TaqMan RT-PCR檢測(cè)方法,可應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)室和臨床診斷。

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結(jié)果圖1KOUTV檢測(cè)體系特異性驗(yàn)證結(jié)果Figure1EvaluationofspecificityofTaqManRT-PCRassayforKOUTVdetection表2KOUTV檢測(cè)體系重復(fù)穩(wěn)定性

2.4檢測(cè)體系穩(wěn)定性7個(gè)不同濃度（1×102～1×108拷貝/反應(yīng)）RNA樣品的3次平行重復(fù)實(shí)驗(yàn)，各樣品Ct值的s值均小于0.5，CV值均小于1.5%（表2），這表明該檢測(cè)體系穩(wěn)定性良好。2.5蚊蟲樣本檢測(cè)采集112批次共6328只蚊蟲，對(duì)標(biāo)本研磨液提取RNA后，利用建立的Taq....

圖2KOUTV基因拷貝數(shù)定量分析標(biāo)準(zhǔn)曲線Figure2StandardcurveofKOUTVTaqMan

UTVdetection稀釋度Ct值ˉxsCV(%)第1輪第2輪第3輪1×10814.3914.4514.4314.420.020.141×10716.4016.4516.4316.430.020.121×10619.6120.0620.0819.920.221.101×1052....

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