本研究在人絨毛膜促性腺激素(hCG)的結(jié)合多肽的基礎(chǔ)上應(yīng)用嫁接抗體技術(shù)制備抗hCG單域抗體,簡(jiǎn)化單域抗體制備過(guò)程,提高多肽生化穩(wěn)定性。利用單域抗體通用骨架(cAbBCII10),以hCG結(jié)合多肽取代互補(bǔ)決定區(qū)CDR1或CDR3,合成cAbBCII10嫁接抗體全基因序列并與sfGFP基因序列融合后,插入到帶有His標(biāo)簽的原核表達(dá)載體pET30a(+)中,成功構(gòu)建了pET30a-(His6)-cAbBCII10-CDR1/hCGBP1-sfGFP與pET30a-(His6)-c AbBCII10-CDR3/hCGBP3-sfGFP融合蛋白表達(dá)質(zhì)粒。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3),用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)融合蛋白,得到高表達(dá)量的可溶性融合蛋白。利用Ni-NTA親和柱純化得到純蛋白,應(yīng)用SDS-PAGE鑒定純化的蛋白為正確表達(dá)的目標(biāo)蛋白。通過(guò)抗原抗體結(jié)合實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)hCG結(jié)合多肽嫁接到單域抗體通用骨架的互補(bǔ)決定區(qū)CDR1或CDR3后都有抗原結(jié)合活性,具有相似的抗體滴度,且嫁接到CDR3后的抗原結(jié)合活性比CDR1要高(2-3倍)。嫁接抗體基本保留了所用單域抗體框架較為穩(wěn)定的生化特性、具有一定的...

【文章頁(yè)數(shù)】：59 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

圖1重組質(zhì)粒pET30a-anti-hCG-α和pET30a-

P重組子經(jīng)BamHⅠ和HindⅢ酶切鑒定后得到兩條目的帶，大小約為5.3kb和1.2kb，分別與質(zhì)粒和抗體基因及抗體融合蛋白基因片段的預(yù)期分子量一致(圖1)。將酶切鑒定正確的質(zhì)粒進(jìn)行DNA測(cè)序鑒定，測(cè)序結(jié)果與預(yù)期的序列一致，證明3個(gè)重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。2.2融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)分析將....

圖2anti-hCG-和cAbBCII10-hCGBP1/3-sfGFP融合蛋白的表達(dá)Fig.2Expressionofanti-hCG-andcAbBCII10-hCGBP1/3-sfGFPfusionproteins.(A)Expressionof

單域抗體：010-64807509：cjb@im.ac.cn573SDS-PAGE分析，結(jié)果如圖2所示。經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，在3組樣品中均獲得了目標(biāo)蛋白的高表達(dá)，并且大部分存在于細(xì)菌裂解液的上清中，為可溶性蛋白，僅有少量在沉淀中。2.3融合蛋白的純化與鑒定pET30a-anti-h....

圖4融合蛋白cAbBCII10-hCGBP1/3-sfGFP結(jié)合hCG的活性測(cè)定

SSN1000-3061CN11-1998/Q生物工程學(xué)報(bào)ChinJBiotechhttp://journals.im.ac.cn/cjbcn5742.4融合蛋白的濃度測(cè)定及抗體融合蛋白的抗原結(jié)合活性分析通過(guò)BSA蛋白測(cè)定法可以得出pET30a-anti-hCG-α、pET30a....

圖5抗體融合蛋白的穩(wěn)定性測(cè)定Fig.5DeterminationofthestabilityofcAbBCII10-

彭靜等/利用抗原結(jié)合多肽嫁接抗體技術(shù)制備抗hCG單域抗體：010-64807509：cjb@im.ac.cn575圖5抗體融合蛋白的穩(wěn)定性測(cè)定Fig.5DeterminationofthestabilityofcAbBCII10-hCGBP1/3-sfGFPfusionprote....

本文編號(hào)：3939341