自然殺傷細胞(Natural killer cells,NK cells)因其天然的殺傷能力而得名。從1975年的偶然發(fā)現(xiàn)到如今被免疫學(xué)家和臨床醫(yī)生寄予厚望,學(xué)界對NK細胞的認識經(jīng)歷了從最早CD56+CD3-簡單表型描述到鑒定NK細胞是機體抗病毒和抗腫瘤的天然淋巴細胞重要亞群之一的漫長過程。NK細胞不僅是宿主防御中的“哨兵”,而且可以通過分泌細胞因子和趨化因子在維持組織穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。體內(nèi)成熟NK細胞數(shù)量的異常對腫瘤的發(fā)生發(fā)展,甚至是對自身免疫疾病發(fā)生都有重要影響。但是,目前無論是NK細胞功能分子的研究,還是促進NK細胞發(fā)育成熟調(diào)控因子的研究,仍主要局限于IFN-γ和IL-15等少數(shù)細胞因子。生長促進因子作為一類廣泛表達且對于細胞發(fā)育成熟非常作用的細胞因子,在NK細胞的研究中鮮有報道。同時,NK細胞功能的研究仍主要集中于外周NK細胞在宿主防御中的作用,但是關(guān)于組織居留NK(Tissue-Resident NK,trNK)細胞的組織特異性功能報道甚少。人外周血中,NK細胞約占淋巴細胞總數(shù)的10%。但是在子宮組織中,隨著妊娠反應(yīng)的開始,子宮內(nèi)膜迅速蛻膜化,NK細胞數(shù)量迅速增加,最高可達...

【文章頁數(shù)】：132 頁

【學(xué)位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
符號說明
第一章 緒論NK細胞發(fā)育和功能的研究進展
    1.1 引言
    1.2 NK細胞的研究簡史
    1.3 多組學(xué)聯(lián)合分析助力NK細胞發(fā)育和功能的研究
        1.3.1 基因組學(xué)分析
        1.3.2 轉(zhuǎn)錄組學(xué)與蛋白質(zhì)組學(xué)分析
        1.3.3 多組學(xué)聯(lián)合分析
    1.4 NK細胞表型的多樣性
    1.5 NK細胞功能的多樣性
        1.5.1 NK細胞的抗腫瘤、抗病毒功能
        1.5.2 NK細胞的免疫調(diào)節(jié)功能
        1.5.3 NK細胞促進胚胎植入的功能
    1.6 NK細胞的發(fā)育和成熟
        1.6.1 NK細胞發(fā)育的微環(huán)境
        1.6.2 NK細胞發(fā)育和成熟的程序化
        1.6.3 細胞因子促進NK細胞發(fā)育和成熟
        1.6.4 生長促進因子促進NK細胞發(fā)育和成熟
        1.6.5 轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控NK細胞發(fā)育和成熟
第二章 材料與方法
    2.1 實驗材料
        2.1.1 臨床標(biāo)本
        2.1.2 實驗動物
        2.1.3 細菌培養(yǎng)及相關(guān)試劑
        2.1.4 RNA體外轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒及相關(guān)試劑
        2.1.5 質(zhì)粒及抽提、轉(zhuǎn)染試劑
        2.1.6 細胞電核轉(zhuǎn)試劑
        2.1.7 細胞系及培養(yǎng)基
        2.1.8 細胞因子及生長促進因子
        2.1.9 抗體
        2.1.10 細胞分離和純化試劑
        2.1.11 總RNA提取和RT-PCR試劑
        2.1.12 核酸序列
        2.1.13 PCR試劑和核酸電泳試劑
        2.1.14 熒光定量PCR試劑
        2.1.15 SDS-PAGE電泳和Western blotting試劑
        2.1.16 免疫熒光及流式內(nèi)標(biāo)檢測試劑
        2.1.17 蛋白純化試劑
        2.1.18 NK細胞ChIP實驗試劑
        2.1.19 熒光素報告實驗試劑
        2.1.20 DNA-pull down實驗試劑
    2.2 實驗儀器
    2.3 實驗方法
        2.3.1 人單個核細胞分離及NK細胞純化
        2.3.2 小鼠組織單個核細胞分離
        2.3.3 人NK細胞純化及基因芯片數(shù)據(jù)分析
        2.3.4 細胞總RNA提取和RT-PCR
        2.3.5 熒光定量PCR
        2.3.6 流式細胞術(shù)
        2.3.7 免疫熒光實驗
        2.3.8 細胞干擾和過表達實驗
        2.3.9 基因編輯小鼠構(gòu)建
        2.3.10 NK細胞相關(guān)基因保守性分析
        2.3.11 PBX1蛋白的表達和純化
        2.3.12 PBX1的抗體制備
        2.3.13 人臍血干細胞純化及NK細胞體外分化擴增
        2.3.14 細胞Western blotting
        2.3.15 NK細胞ChIP-Seq實驗
        2.3.16 熒光素酶報告實驗
        2.3.17 DNA-pull down實驗
        2.3.18 骨髓嵌合體小鼠模型
        2.3.19 小鼠骨髓細胞混合轉(zhuǎn)輸模型
        2.3.20 統(tǒng)計學(xué)分析
第三章 NK細胞產(chǎn)生生長促進因子促進胚胎發(fā)育
    3.1 引言
    3.2 基因芯片差異分析子宮trNK細胞和外周血NK細胞
        3.2.1 子宮NK細胞與外周NK細胞基因表達譜存在顯著差異
        3.2.2 子宮CD49a⁺NK細胞表達多種生長促進因子
    3.3 子宮NK細胞分泌生長促進因子PTN和OGN
        3.3.1 子宮CD49a⁺ NK細胞表達PTN和OGN等生長促進因子
        3.3.2 子宮CD11b^-CD27^-NK細胞和trNK細胞表達生長促進因子
    3.4 HLA-G誘導(dǎo)NK細胞分泌生長促進因子
        3.4.1 HLA-G+絨毛外滋養(yǎng)層細胞促進NK細胞分泌生長促進因子
        3.4.2 HLA-G-ILT2-KIR2DL4互作促進NK細胞分泌生長促進因子
    3.5 異常發(fā)育的胚胎HLA-G表達量顯著降低
    3.6 反復(fù)流產(chǎn)病人NK細胞分泌生長促進因子能力顯著降低
        3.6.1 反復(fù)流產(chǎn)病人產(chǎn)生生長促進因子的NK細胞功能亞群顯著減少
        3.6.2 反復(fù)流產(chǎn)病人NK細胞表達生長促進因子的能力顯著下降
    3.7 Ptn^-/-Ogn^-/-Spp1^-/-小鼠胚胎發(fā)育受限
        3.7.1 Ptn^-/-Ogn^-/-Spp1^-/-小鼠構(gòu)建及驗證
        3.7.2 Ptn^-/-Ogn^-/-Spp1^-/-小鼠胚胎發(fā)育受限
    3.8 討論與總結(jié)
第四章 PBX1促進NK細胞在骨髓中的發(fā)育成熟
    4.1 引言
    4.2 生長促進因子支持NK細胞成熟
        4.2.1 NK細胞發(fā)育過程中表達生長促進因子
        4.2.2 Ptn^-/-Ogn^-/-小鼠模型證明生長促進因子促進NK細胞在骨髓成熟
        4.2.3 骨髓混合轉(zhuǎn)輸模型證明PTN和OGN促進NK細胞在骨髓成熟
        4.2.4 骨髓成熟NK細胞表達生長促進因子受體RPTP-β
    4.3 PBX1是NK細胞一個高度保守的轉(zhuǎn)錄因子
        4.3.1 PBX1在物種進化過程中高度保守
        4.3.2 PBX1在人骨髓NK細胞中高表達
        4.3.3 PBX1在骨髓CD11b⁺單陽性NK細胞中高表達
    4.4 PBX1促進NK細胞表達PTN和OGN
        4.4.1 生物信息學(xué)預(yù)測PTN和OGN是PBX1的靶基因
        4.4.2 在NK細胞中干擾PBX1表達抑制PTN和OGN表達
        4.4.3 在NK細胞分化體系中過表達PBX1促進PTN和OGN表達
    4.5 PBX1直接結(jié)合PTN和OGN啟動子促進其轉(zhuǎn)錄
        4.5.1 CHIP-seq結(jié)果證明在PTN和OGN啟動子區(qū)有PBX1結(jié)合峰
        4.5.2 熒光素酶報告實驗驗證PBX1結(jié)合PTN和OGN啟動子區(qū)
        4.5.3 DNA-pulldown驗證PBX1結(jié)合PTN和OGN啟動子中特異性序列
    4.6 Pbx1缺陷小鼠NK細胞數(shù)量嚴(yán)重減少
        4.6.1 骨髓嵌合體小鼠模型證明Pbx1促進NK細胞發(fā)育
        4.6.2 Pbx1條件型敲除小鼠模型證明Pbx1促進NK細胞發(fā)育
    4.7 PBX1促進NK細胞在骨髓的成熟
        4.7.1 Pbx1條件型敲除小鼠模型證明PBX1促進NK細胞成熟
        4.7.2 PTN/OGN恢復(fù)實驗證明PBX1-PTN/OGN軸促進NK細胞成熟
    4.8 PBX1-PTN/OGN軸通過上調(diào)T-bet表達促進NK細胞成熟
        4.8.1 PBX1-PTN/OGN軸促進骨髓NK細胞的增殖和遷出骨髓能力
        4.8.2 PBX1-PTN/OGN軸上調(diào)骨髓NK細胞轉(zhuǎn)錄因子T-bet的表達
    4.9 討論與總結(jié)
參考文獻
致謝
攻讀博士學(xué)位期間的主要研究成果
附錄



本文編號：3938536