二十二碳六烯酸(DHA)是維持人體正常生長發(fā)育的重要成分。DHA作為人體必需不飽和脂肪酸,不能在人體內直接合成,只能從飲食中攝取。隨著微藻源DHA在食品添加中的普遍應用,微藻源DHA的質量安全也逐漸受到消費者的關注。雖然有關DHA的研究報道和商業(yè)產品層出不窮,但目前市場上尚未生產出檢測微藻源DHA含量的金標快速檢測產品。為此,本課題在參考前人研究半抗原偶聯技術、抗體制備技術等基礎上,研究制備微藻源DHA偶聯抗原和抗體。并對DHA抗原抗體在膠體金免疫層析技術上的應用進行初步探討。本實驗通過碳化二亞胺活性酯法和混合酸酐法,合成免疫抗原DHA-BSA和包被抗原DHA-OVA。通過蛋白電泳、紅外光譜掃描、紫外光譜掃描分析,半抗原DHA與載體蛋白BSA、OVA偶聯成功,且免疫抗原的偶聯比為4:1和17:1,在適宜的偶聯比范圍內。用免疫抗原對Balb/c小鼠進行四次免疫,并取血清進行效價檢測。最終選用20μg/ml的包被抗原進行包被,5%脫脂奶粉進行封閉,測得多抗血清效價為128000。通過阻斷ELISA測定,DHA抗體的敏感性IC50為40.44μg/ml。用蛋白純化柱Protein G對抗體進...

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【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第一章 緒論
    1.1 課題研究背景
    1.2 DHA概述
        1.2.1 DHA簡介
        1.2.2 DHA的來源
        1.2.3 DHA的生理功能
        1.2.4 DHA的應用及添加量
        1.2.5 常用檢測方法
            1.2.5.1 氣相色譜法(GC)
            1.2.5.2 氣相色譜-質譜聯用法(GC-MS)
            1.2.5.3 高效液相色譜法(HPLC)
    1.3 人工抗原合成方法及其原理
        1.3.1 人工抗原簡介
        1.3.2 載體的選擇
        1.3.3 偶聯方法的選擇
    1.4 膠體金免疫層析技術概述
        1.4.1 膠體金及其制備
        1.4.2 膠體金免疫層析技術及其原理
        1.4.3 膠體金免疫層析技術分類
            1.4.3.1 間接法制備膠體金免疫層析試紙條
            1.4.3.2 競爭法制備膠體金免疫層析試紙條
            1.4.3.3 夾心法制備膠體金免疫層析試紙條
        1.4.4 膠體金免疫層析技術在食品安全檢測中的應用
            1.4.4.1 農藥獸藥殘留檢測
            1.4.4.2 病原微生物的檢測
            1.4.4.3 食品中其他小分子物質的檢測
        1.4.5 膠體金免疫層析技術的發(fā)展趨勢
    1.5 本課題研究目的及意義、研究內容和創(chuàng)新之處
        1.5.1 本課題研究目的及意義
        1.5.2 本課題主要研究內容
        1.5.3 本課題創(chuàng)新之處
        1.5.4 課題研究的技術路線
第二章 材料與方法
    2.1 實驗儀器設備
    2.2 實驗材料及試劑
        2.2.1 實驗動物
        2.2.2 實驗試劑耗材
        2.2.3 實驗耗材
        2.2.4 實驗所需試劑的配制
            2.2.4.1 DHA人工抗原制備及鑒定所需溶液的配制
            2.2.4.2 抗體純化鑒定所需溶液的配制
            2.2.4.3 金標檢測卡所需溶液的配制
    2.3 實驗方法
        2.3.1 DHA人工抗原的制備及其鑒定
            2.3.1.1 免疫抗原(DHA-BSA)的制備
            2.3.1.2 包被抗原(DHA-OVA)的制備
            2.3.1.3 DHA人工抗原的鑒定
        2.3.2 DHA抗體的制備
            2.3.2.1 小鼠免疫
            2.3.2.2 血清效價檢測
            2.3.2.3 細胞融合
            2.3.2.4 雜交瘤細胞篩選
        2.3.3 DHA抗體的純化與鑒定
            2.3.3.1 抗體純化
            2.3.3.2 抗體濃度測定
            2.3.3.3 SDS-PAGE蛋白電泳檢測
        2.3.4 膠體金的制備及其表征研究
            2.3.4.1 膠體金的制備
            2.3.4.2 膠體金制備影響因素的測定
            2.3.4.3 膠體金鑒定
        2.3.5 DHA金標檢測卡的初步探究
            2.3.5.1 金標記抗體的制備
            2.3.5.2 金標記抗體的穩(wěn)定性
            2.3.5.3 金標記抗體效果的鑒定
            2.3.5.4 金標檢測卡的組裝及性能測試
第三章 結果與討論
    3.1 免疫抗原的鑒定與分析
        3.1.1 蛋白電泳鑒定
        3.1.2 紅外掃描鑒定
        3.1.3 紫外全波長掃描
        3.1.4 免疫抗原偶聯比測定
    3.2 抗體的制備與鑒定
        3.2.1 多克隆抗體效價檢測
            3.2.1.1 包被濃度的確定
            3.2.1.2 封閉液的選擇
            3.2.1.3 抗血清效價的檢測
            3.2.1.4 競爭抑制的測定
        3.2.2 單克隆抗體的制備與測定
            3.2.2.1 細胞融合
            3.2.2.2 雜交瘤細胞的檢測與篩選
        3.2.3 抗體的純化及鑒定
            3.2.3.1 抗體純化前后濃度測定
            3.2.3.2 抗體純度測定
    3.3 膠體金的制備及表征研究
        3.3.1 檸檬酸三鈉添加量對膠體金溶液的影響
            3.3.1.1 檸檬酸三鈉對膠體金溶液表觀狀態(tài)的影響
            3.3.1.2 膠體金溶液的可見光光譜分析
            3.3.1.3 膠體金顆粒大小的選擇
        3.3.2 K₂CO₃添加量對膠體金溶液的影響
            3.3.2.1 K₂CO₃添加量對膠體金表觀特征的影響
            3.3.2.2 膠體金溶液的可見光譜分析
    3.4 DHA金標檢測卡的初步探究
        3.4.1 金標抗體的制備
            3.4.1.1 膠體金標記抗體最適pH的確定
            3.4.1.2 最適抗體標記量的確定
        3.4.2 金標記抗體效果的鑒定
        3.4.3 DHA金標檢測卡的組裝及性能測試
結論與展望
    結論
    展望
參考文獻
致謝
個人簡歷
研究成果



本文編號：3921967