目前,抗體片段Fab在治療人類多種疾病(如癌癥、病毒感染、炎癥等)方面起著重要作用。由于其缺少糖基化的Fc區(qū),因此并不需要進(jìn)行糖基化修飾。此結(jié)構(gòu)特點(diǎn)使得Fab可在大腸桿菌中進(jìn)行活性表達(dá)。Escherichia coli作為宿主菌株的突出優(yōu)勢(shì)在于低成本、生長(zhǎng)快、易控制,在短時(shí)間內(nèi)可以獲得高產(chǎn)量,因此,已逐漸成為生產(chǎn)抗體的中堅(jiān)力量。但是,在E.coli中生產(chǎn)抗體片段Fab的主要限制因素在于Fab的產(chǎn)量較低,原因主要是Fab易在胞質(zhì)中錯(cuò)誤折疊、聚集,形成無生物學(xué)活性的包涵體,且宿主菌中含有多種蛋白酶,對(duì)Fab有一定的降解作用等。因此,為提高抗體產(chǎn)量,可以從表達(dá)載體、宿主菌株、分子伴侶及折疊酶等幾個(gè)方面著手,以期達(dá)到理想目標(biāo)。本課題從三方面對(duì)Fab的表達(dá)進(jìn)行了優(yōu)化:1)在實(shí)驗(yàn)室前期工作基礎(chǔ)上,以E.coli DH11 T7為宿主菌株,通過構(gòu)建不同的Fab表達(dá)載體,最終提高Fab在E.coli中的產(chǎn)量;2)在1)工作的基礎(chǔ)上,通過共表達(dá)多種分子伴侶,進(jìn)一步提高Fab在E.coli中的產(chǎn)量;3)在E.coli周質(zhì)蛋白酶缺陷菌株DHll-ptr-degp(以下簡(jiǎn)稱86D)的基礎(chǔ)上,對(duì)其基因組上spr...

【文章頁數(shù)】：88 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
縮略詞說明
前言
    1.小分子抗體在大腸桿菌中的表達(dá)
    2.小分子抗體在大腸桿菌中分泌表達(dá)的研究進(jìn)展
    3.本課題研究?jī)?nèi)容
第一章 抗VEGF抗體Fab片段表達(dá)載體構(gòu)建及信號(hào)肽優(yōu)化
    1.1 材料
        1.1.1 菌株和質(zhì)粒
        1.1.2 引物
        1.1.3 培養(yǎng)基及溶液
        1.1.4 試劑
        1.1.5 分子量標(biāo)志物
        1.1.6 工具酶
        1.1.7 試劑盒
        1.1.8 生物信息學(xué)軟件
        1.1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
        1.1.10 主要儀器和設(shè)備
    1.2 方法
        1.2.1 瓊脂糖凝膠DNA片段的回收
        1.2.2 質(zhì)粒的提取
        1.2.3 化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞的制備與化學(xué)轉(zhuǎn)化法
            1.2.3.1 化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞的制備(參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南第三版》)
            1.2.3.2 化學(xué)轉(zhuǎn)化法
        1.2.4 構(gòu)建信號(hào)肽突變體
        1.2.5 構(gòu)建Fab表達(dá)載體
        1.2.6 不同表達(dá)菌株生長(zhǎng)曲線的測(cè)定
        1.2.7 全菌蛋白的SDS-PAGE分析及Western Blot
        1.2.8 Fab含量測(cè)定及分析
        1.2.9 Protein L親和層析柱純化抗體片段Fab
        1.2.10 抗體蛋白Fab濃度的測(cè)定
            1.2.10.1 BCA試劑盒測(cè)蛋白濃度
            1.2.10.2 依據(jù)CurveExpert軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線
    1.3 結(jié)果
        1.3.1 Fab表達(dá)載體的構(gòu)建
        1.3.2 Fab表達(dá)載體的篩選
        1.3.3 DsbA及STII系列表達(dá)Fab載體的構(gòu)建
        1.3.4 DsbA及STII系列表達(dá)Fab載體的篩選
        1.3.5 抗VEGF-Fab的蛋白制備
    1.4 討論
第二章 分子伴侶表達(dá)載體的篩選
    2.1 材料
        2.1.1 菌株和質(zhì)粒
        2.1.2 引物
        2.1.3 培養(yǎng)基及溶液
        2.1.4 試劑
        2.1.5 分子量標(biāo)志物
        2.1.6 工具酶
        2.1.7 試劑盒
        2.1.8 生物信息學(xué)軟件
        2.1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
        2.1.10 主要儀器和設(shè)備
    2.2 方法
        2.2.1 瓊脂糖凝膠DNA片段的回收
        2.2.2 質(zhì)粒的提取
        2.2.3 大腸桿菌基因組的提取
        2.2.4 化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞的制備與化學(xué)轉(zhuǎn)化法
        2.2.5 構(gòu)建分子伴侶表達(dá)載體
        2.2.6 不同分子伴侶在大腸桿菌DH11T7中的篩選
            2.2.6.1 不同分子伴侶在大腸桿菌DH11T7中的菌株生長(zhǎng)特征
            2.2.6.2 不同分子伴侶在大腸桿菌DH11T7中Fab的表達(dá)差異
    2.3 結(jié)果
        2.3.1 分子伴侶表達(dá)載體的構(gòu)建
        2.3.2 分子伴侶表達(dá)載體的篩選
    2.4 討論
第三章 蛋白酶缺陷菌株的構(gòu)建及發(fā)酵工藝
    3.1 材料
        3.1.1 菌株和質(zhì)粒
        3.1.2 引物
        3.1.3 培養(yǎng)基及溶液
        3.1.4 試劑
        3.1.5 分子量標(biāo)志物
        3.1.6 工具酶
        3.1.7 試劑盒
        3.1.8 生物信息學(xué)軟件
        3.1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
        3.1.10 主要儀器和設(shè)備
    3.2 方法
        3.2.1 瓊脂糖凝膠DNA片段的回收
        3.2.2 質(zhì)粒的提取
        3.2.3 大腸桿菌基因組的提取
        3.2.4 化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞的制備與化學(xué)轉(zhuǎn)化法
        3.2.5 spr點(diǎn)突變菌株的構(gòu)建
            3.2.5.1 供體質(zhì)粒p15AD2IC-Mspr-SacB的構(gòu)建
            3.2.5.2 利用供體質(zhì)粒p15AD2IC-Mspr-SacB實(shí)現(xiàn)spr點(diǎn)突變
        3.2.6 發(fā)酵培養(yǎng)基配方確定
        3.2.7 起始培養(yǎng)基中葡萄糖濃度的篩選
        3.2.8 蛋白酶缺陷菌株的發(fā)酵工藝
        3.2.9 不同蛋白酶缺陷菌株的發(fā)酵工藝
    3.3 結(jié)果
        3.3.1 構(gòu)建spr基因突變的蛋白酶缺陷菌株
            3.3.1.1 供體質(zhì)粒p15AD2IC-Mspr-SacB的構(gòu)建
            3.3.1.2 Cm抗性基因整合鑒定
            3.3.1.3 spr點(diǎn)突變菌株鑒定
        3.3.2 發(fā)酵培養(yǎng)基搖瓶篩選
        3.3.3 起始培養(yǎng)基中初始葡萄糖濃度的確定
        3.3.4 蛋白酶缺陷菌株的發(fā)酵工藝
        3.3.5 不同蛋白酶缺陷菌株的發(fā)酵工藝
    3.4 討論
總結(jié)與展望
參考文獻(xiàn)
附錄一: 引物序列
附錄二: 信號(hào)肽序列
致謝
在讀期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文與取得的其他研究成果



本文編號(hào)：3867665