結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)簡(jiǎn)稱結(jié)核桿菌,是結(jié)核病的病原菌,目前世界上約1/3的人口感染結(jié)核分枝桿菌,其中5%-10%的感染者將發(fā)展成為活動(dòng)性結(jié)核病,全球每年新增結(jié)核病患者約880萬(wàn),死亡約300萬(wàn)。細(xì)胞凋亡是細(xì)胞發(fā)生的一種程序性死亡,在組織分化、器官發(fā)育、機(jī)體穩(wěn)態(tài)等生理過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。盡管細(xì)胞凋亡是一種正常的生理現(xiàn)象,但是異常的細(xì)胞凋亡常引起許多疾病。調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞凋亡是結(jié)核分枝桿菌致病性的一部分,影響結(jié)核分枝桿菌的生存、繁殖、擴(kuò)散等過(guò)程�？焖贉�(zhǔn)確的檢測(cè)細(xì)胞凋亡是研究凋亡相關(guān)機(jī)制以及評(píng)價(jià)凋亡對(duì)疾病過(guò)程影響的基礎(chǔ)。Caspase-3的激活是細(xì)胞凋亡的重要標(biāo)志,常被應(yīng)用于凋亡檢測(cè)方法的建立。為了方便快速的檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌蛋白對(duì)細(xì)胞凋亡的影響,本研究將caspase-3的識(shí)別序列與螢火蟲(chóng)熒光素酶融合表達(dá)構(gòu)建了一個(gè)新型的caspase-3報(bào)告質(zhì)粒,用于細(xì)胞凋亡的檢測(cè),并篩選了部分結(jié)核分枝桿菌編碼的蛋白,具體研究?jī)?nèi)容如下:1.Caspase-3報(bào)告質(zhì)粒的構(gòu)建及驗(yàn)證本研究構(gòu)建了四種caspase-3報(bào)告質(zhì)粒,將四種報(bào)告質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染He La細(xì)胞,在細(xì)胞...

【文章頁(yè)數(shù)】：61 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
縮略語(yǔ)表（ABBREVIATION）
第1章 文獻(xiàn)綜述
    1.1 細(xì)胞凋亡簡(jiǎn)介
    1.2 細(xì)胞凋亡特征
        1.2.1 細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)特征
        1.2.2 DNA片段化
        1.2.3 組織谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶活化
    1.3 細(xì)胞凋亡信號(hào)通路
        1.3.1 死亡受體通路
        1.3.2 線粒體通路
        1.3.3 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路
    1.4 細(xì)胞凋亡檢測(cè)方法
        1.4.1 形態(tài)學(xué)觀察
        1.4.2 DNA片段化檢測(cè)
        1.4.3 磷脂酰絲氨酸定位檢測(cè)
        1.4.4 凋亡相關(guān)基因檢測(cè)
        1.4.5 新型細(xì)胞凋亡檢測(cè)方法
    1.5 結(jié)核分枝桿菌與細(xì)胞凋亡
        1.5.1 抑制細(xì)胞凋亡
        1.5.2 促進(jìn)細(xì)胞凋亡
        1.5.3 ESAT-6 家族蛋白與細(xì)胞凋亡
第2章 目的與意義
第3章 材料與方法
    3.1 試驗(yàn)材料
        3.1.1 細(xì)胞與菌株
        3.1.2 引物、載體
        3.1.3 工具酶及主要試劑
        3.1.4 培養(yǎng)基和抗生素的配制
        3.1.5 主要緩沖液和試劑及其配制
        3.1.6 主要實(shí)驗(yàn)儀器及設(shè)備
        3.1.7 分子生物學(xué)分析軟件
        3.1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
    3.2 試驗(yàn)方法
        3.2.1 報(bào)告質(zhì)粒的構(gòu)建
        3.2.2 ESAT-6 家族蛋白真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建
        3.2.3 酶切產(chǎn)物回收與純化
        3.2.4 外源DNA片段與質(zhì)粒載體的連接反應(yīng)
        3.2.5 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備（氯化鈣法）
        3.2.6 連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化
        3.2.7 質(zhì)粒的制備與鑒定
        3.2.8 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染（脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染法）
        3.2.9 雙熒光素酶檢測(cè)實(shí)驗(yàn)
        3.2.10 細(xì)胞凋亡檢測(cè)
        3.2.11 實(shí)時(shí)熒光定量PCR
        3.2.12 Western Blot樣品準(zhǔn)備
第4章 結(jié)果與分析
    4.1 Caspase-3 報(bào)告質(zhì)粒的構(gòu)建
    4.2 Caspase-3 報(bào)告質(zhì)粒的驗(yàn)證
    4.3 結(jié)核分枝桿菌ESAT-6 家族蛋白的篩選
    4.4 篩選結(jié)果的驗(yàn)證
    4.5 核因子-kB（NF-kB）參與esxT誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡
第5章 討論與結(jié)論
    5.1 討論
        5.1.1 Npu DnaE內(nèi)含肽的選擇
        5.1.2 真核表達(dá)的選擇
        5.1.3 促進(jìn)TNF-α 誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的篩選
        5.1.4 結(jié)核分枝桿菌ESAT-6 家族蛋白的篩選及驗(yàn)證
    5.2 結(jié)論
參考文獻(xiàn)
致謝
附錄



本文編號(hào)：3865684