第一部分鉤端螺旋體M23超家族金屬內(nèi)肽酶活性及致病性研究研究背景及意義:鉤端螺旋體(以下簡稱鉤體)病是由致病性鉤體感染引起的自然疫源性人畜共患傳染病,也是我國重點(diǎn)防疫和監(jiān)控的主要傳染病之一。根據(jù)致病性可將鉤體分為致病性和非致病性兩大類,問號鉤體(Leptospira interrogans)是流行最廣的致病性鉤體基因種,我國則以問號鉤體黃疸出血群賴型為優(yōu)勢流行的血清群型。致病性鉤體具有強(qiáng)大的侵襲力,能迅速穿越皮膚和黏膜侵入人體,也能從血流中穿越血管壁擴(kuò)散多種臟器和組織,但其侵襲力的物質(zhì)基礎(chǔ)及機(jī)制迄今未完全明了。金屬蛋白酶(metalloprotease,MP)是一群能水解蛋白或多肽的酶類,問號鉤體黃疸出血群賴型賴株基因組中具有多個(gè)產(chǎn)物注釋為MP的基因,但其酶活性和致病作用尚無報(bào)道。研究方法:采用生物信息學(xué)軟件分析問號鉤體黃疸出血群賴型賴株LA2582和LA2901基因產(chǎn)物信號肽、跨膜區(qū)和功能結(jié)構(gòu)域。構(gòu)建LA2582和LA2901基因胞外區(qū)原核表達(dá)系統(tǒng),采用Ni-NTA親和層析法提純目的重組表達(dá)產(chǎn)物rLA2582和rLA2901,采用SDS-PAGE及Bio-Rad凝膠圖像分析系統(tǒng)檢測其...

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【學(xué)位級別】：碩士

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中文摘要
    第一部分 鉤端螺旋體M23超家族金屬內(nèi)肽酶活性及致病性研究
    第二部分 不可分型流感嗜血桿菌OMP6優(yōu)勢抗原表位篩選與鑒定
Abstract
    Part-Ⅰ Activity and pathogenicity of M23 superfamily metalloendopeptidases ofLeptospira interrogans
    Part-Ⅱ Screening and identification of predominant antigenic epitopes in OMP6 ofnontypeable Haemophilus influenzae
英文縮寫詞表
第一部分 鉤端螺旋體M23超家族金屬內(nèi)肽酶活性及致病性研究
    第1章 引言
        1.1 鉤端螺旋體
        1.2 鉤端螺旋體病
        1.3 細(xì)菌胞外金屬蛋白酶
        1.4 研究內(nèi)容及目的
            1.4.1 研究內(nèi)容
            1.4.2 研究目的
        1.5 研究路線
    第2章 原核表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建及表達(dá)產(chǎn)物抗體的制備
        2.1 材料
            2.1.1 實(shí)驗(yàn)菌株
            2.1.2 實(shí)驗(yàn)質(zhì)粒
            2.1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
            2.1.4 主要儀器及器材
            2.1.5 主要試劑
            2.1.6 主要試劑配制
        2.2 方法
            2.2.1 問號鉤體LA2582和LA2901基因序列生物信息學(xué)分析
            2.2.2 問號鉤體的培養(yǎng)
            2.2.3 問號鉤體基因組DNA的提取
            2.2.4 目的基因的擴(kuò)增和純化
                2.2.4.1 引物設(shè)計(jì)
                2.2.4.2 目的基因的擴(kuò)增
                2.2.4.3 PCR擴(kuò)增片段的純化
            2.2.5 T-A克隆
                2.2.5.1 大腸桿菌DH5a和BL21DE3感受態(tài)細(xì)胞的制備
                2.2.5.2 連接
                2.2.5.3 轉(zhuǎn)化
                2.2.5.4 目的重組質(zhì)粒的提取
                2.2.5.5 質(zhì)粒pMD19-T^LA2582和pMD19-T^LA2901的雙酶切鑒定
            2.2.6 LA2582和LA2901基因原核表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建及其重組蛋白的純化
                2.2.6.1 目的基因片段的回收
                2.2.6.2 連接
                2.2.6.3 轉(zhuǎn)化
                2.2.6.4 重組表達(dá)質(zhì)粒的提取
                2.2.6.5 質(zhì)粒pET-42a^LA2582和pET-42a^LA2901的雙酶切鑒定
                2.2.6.6 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)
                2.2.6.7 SDS-PAGE電泳
                2.2.6.8 重組蛋白rLA2582和rLA2901的提取與純化
                2.2.6.9 rLA2582-IgG和rLA2901-IgG制備
                2.2.6.10 免疫雙向擴(kuò)散法檢測rLA2582-IgG和rLA2901-IgG效價(jià)
        2.3 結(jié)果
            2.3.1 問號鉤體LA2582和LA2901基因氨基酸序列跨膜預(yù)測結(jié)果
            2.3.2 問號鉤體LA2582和LA2901基因氨基酸序列信號肽預(yù)測結(jié)果
            2.3.3 問號鉤體LA2582和LA2901基因氨基酸序列功能結(jié)構(gòu)域預(yù)測結(jié)果
            2.3.4 PCR結(jié)果
            2.3.5 T-A克隆鑒定結(jié)果
            2.3.6 亞克隆鑒定結(jié)果
            2.3.7 LA2582和LA2901表達(dá)純化結(jié)果及其抗血清效價(jià)
        2.4 小結(jié)
    第3章 鉤端螺旋體M23金屬內(nèi)肽酶酶學(xué)活性研究
        3.1 材料
            3.1.1 主要試劑
        3.2 方法
            3.2.1 偶氮酪蛋白水解試驗(yàn)
            3.2.2 熒光五肽底物水解試驗(yàn)
            3.2.3 Km和Kcat值測定
            3.2.4 COL1和FN水解試驗(yàn)
            3.2.5 ELN水解試驗(yàn)
        3.3 結(jié)果
            3.3.1 水解活性及Km值和Kcat值
            3.3.2 水解COL1和FN活性
            3.3.3 ELN水解結(jié)果
        3.4 小結(jié)
    第4章 鉤體感染細(xì)胞時(shí)基因mRNA、蛋白表達(dá)及外分泌檢測
        4.1 材料
            4.1.1 實(shí)驗(yàn)菌株
            4.1.2 實(shí)驗(yàn)材料
            4.1.3 主要儀器設(shè)備
            4.1.4 主要試劑
            4.1.5 主要試劑配制
        4.2 方法
            4.2.1 HUVEC的培養(yǎng)
            4.2.2 RT-PCT引物
            4.2.3 建立鉤體感染HUVEC模型
            4.2.4 問號鉤體總RNA的提取
            4.2.5 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)
            4.2.6 qRT-PCR
            4.2.7 鉤體感染HUVEC時(shí)LA2582和LA2901基因產(chǎn)物表達(dá)水平變化
            4.2.8 鉤體感染HUVEC時(shí)LA2582和LA2901基因產(chǎn)物外分泌檢測
        4.3 結(jié)果
            4.3.1 qRT-PCR結(jié)果
            4.3.2 鉤體感染HUVEC時(shí)LA2582和LA2901基因產(chǎn)物表達(dá)水平升高
            4.3.3 鉤體感染HUVEC時(shí)LA2582和LA2901基因產(chǎn)物外分泌水平增加
        4.4 小結(jié)
    第5章 結(jié)果與討論
    參考文獻(xiàn)
第二部分 不可分型流感嗜血桿菌OMP6優(yōu)勢抗原表位篩選與鑒定
    第1章 引言
        1.1 研究背景
        1.2 研究內(nèi)容
        1.3 研究目的
    第2章 TA克隆及基因序列與膜定位分析
        2.1 材料
            2.1.1 菌株來源及其培養(yǎng)
            2.1.2 主要試劑與儀器
        2.2 方法
            2.2.1 NTHi臨床菌株及ATCC49247株基因組DNA的提取
            2.2.2 omp6基因擴(kuò)增及其產(chǎn)物測序
            2.2.3 omp6基因序列和膜定位分析
        2.3 結(jié)果
            2.3.1 omp6基因檢測和分析結(jié)果
            2.3.2 OMP6膜定位分析結(jié)果
        2.4 小結(jié)
    第3章 T-B聯(lián)合抗原表位預(yù)測及其序列的擴(kuò)增、克隆與鑒定
        3.1 實(shí)驗(yàn)材料
            3.1.1 主要實(shí)驗(yàn)試劑
        3.2 方法
            3.2.1 T-B聯(lián)合抗原表位預(yù)測
            3.2.2 T-B聯(lián)合抗原表位肽序列擴(kuò)增、克隆和鑒定
        3.3 結(jié)果
            3.3.1 T-B聯(lián)合抗原表位預(yù)測結(jié)果
            3.3.2 T-B聯(lián)合表位肽編碼序列擴(kuò)增和測序結(jié)果
        3.4 小結(jié)
    第4章 OMP6 M13KE展示肽系統(tǒng)的構(gòu)建及其免疫反應(yīng)性與抗原性檢測
        4.1 材料
            4.1.1 實(shí)驗(yàn)試劑
            4.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器
        4.2 方法
            4.2.1 M13KE展示肽系統(tǒng)構(gòu)建及鑒定
            4.2.2 重組噬菌體擴(kuò)增和提取
            4.2.3 免疫反應(yīng)性檢測
            4.2.4 抗原性檢測
        4.3 結(jié)果
            4.3.1 免疫印跡法檢測結(jié)果
            4.3.2 ELISA檢測結(jié)果
        4.4 小結(jié)
    第5章 結(jié)論
    參考文獻(xiàn)
綜述
    參考文獻(xiàn)
作者簡歷與攻讀學(xué)位期間取得的科研成果



本文編號：3848178