目的構(gòu)建剛地弓形蟲二氫葉酸還原酶-胸苷酸合成酶(dihydrofolate reductase-thymidylate synthase,DHFRTS)-棒狀體蛋白17真核表達載體pIRES/TgDHFR-TS-TgROP17,將其轉(zhuǎn)染人胚腎細胞(HEK 293T)后觀察ROP17對細胞自噬的作用。方法以弓形蟲速殖子總RNA為模板,逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)擴增DHFR-TS基因片段,克隆至真核表達載體pIRES的多克隆位點B,構(gòu)建重組質(zhì)粒pIRES/TgDHFR-TS。經(jīng)菌液PCR、雙酶切和測序鑒定正確后,用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染人胚腎細胞(HEK 293T),RT-PCR法和Western blot檢測DHFR-TS的表達。以弓形蟲速殖子cDNA為模板,PCR獲得ROP17,將其引入重組質(zhì)粒pIRES/TgDHFR-TS的多克隆位點A,構(gòu)建重組載體pIRES/TgDHFR-TSTgROP17。重組載體經(jīng)菌液PCR、雙酶切和測序鑒定后轉(zhuǎn)染人胚腎細胞(HEK 293T),對轉(zhuǎn)染細胞血清饑餓誘導,通過Western blot檢測自噬標志蛋白LC3-Ⅱ、Beclin-1和P62的表達。結(jié)果 RT-...

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【文章目錄】：
材料與方法
    1 材料
        1.1 蟲株、質(zhì)粒、細胞株和菌株
        1.2 主要試劑
    2 方法
        2.1 pIRES/TgDHFR-TS的構(gòu)建
            2.1.1 逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR）引物的設(shè)計和合成
            2.1.2 TgDHFR-TS基因的擴增
            2.1.3 重組表達載體pIRES/TgDHFR-TS的構(gòu)建及鑒定
        2.2 pIRES/TgDHFR-TS轉(zhuǎn)染細胞
        2.3 RT-PCR和Western blot檢測TgDHFR-TS基因和蛋白的表達
        2.4 pIRES/TgDHFR-TS-TgROP17的構(gòu)建
            2.4.1
            2.4.2 重組表達載體及鑒定
        2.5 pIRES/TgDHFR-TS-TgROP17轉(zhuǎn)染細胞
        2.6 RT-PCR和Western blot檢測TgDHFR-TS-TgROP17基因和蛋白的表達
        2.7 Western blot檢測血清饑餓誘導細胞自噬
        2.8 統(tǒng)計學分析
結(jié)果
    1 TgDHFR-TS基因的擴增
    2 pIRES/TgDHFR-TS真核表達載體的構(gòu)建與鑒定
    3 真核表達載體pIRES/TgDHFR-TS在真核細胞中的表達
    4 TgROP17基因的擴增
    5 重組表達載體pIRES/TgDHFR-TS-TgROP17的構(gòu)建及鑒定
    6 真核表達載體pIRES/TgDHFR-TS-TgROP17在真核細胞中的表達
    7 血清饑餓誘導細胞自噬結(jié)果
討論



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