日本腦炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)屬于黃病毒科(Flaviviridae)黃病毒屬(Flavivirus)成員,與其同屬的其它成員包括蜱傳腦炎病毒(TBEV)、登革病毒(DENV)、黃熱病毒(YFV)、和西尼羅病毒(WNV)等,這些均是引起人類致病的重要病原體。JEV病毒是蟲(chóng)媒病毒,感染后引發(fā)乙型腦炎,致死率較高,且多數(shù)幸存者患有嚴(yán)重的神經(jīng)性后遺癥,對(duì)人類健康造成重大威脅。由于野生型病毒潛在的生物安全問(wèn)題在一定程度上限制了對(duì)該病毒的深入研究,所以目前針對(duì)日本腦炎病毒仍然沒(méi)有有效的和特異性的治療方法。因此包裝日本腦炎病毒假毒顆粒(Virus like particles,VLPs)對(duì)于進(jìn)一步開(kāi)展致病機(jī)制、疫苗研究、篩選病毒藥物及開(kāi)發(fā)新型的治療方法具有重要的意義。本次研究以JEV-SA14株基因序列為基礎(chǔ),利用復(fù)制子與結(jié)構(gòu)蛋白反式互補(bǔ)原理包裝JEV VLPs。前期實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建了JEV-Rluc復(fù)制子和VEEV-JEV-CprME克隆:JEV復(fù)制子上帶有海腎熒光素酶(Renilla Luciferase,Rluc)報(bào)告基因,Rluc的表達(dá)水平可快速、...

【文章頁(yè)數(shù)】：56 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
英文摘要
1 前言
    1.1 JEV病毒的病毒學(xué)特征
        1.1.1 JEV病毒的發(fā)現(xiàn)
        1.1.2 JEV病毒的全球分布
        1.1.3 JEV病毒的傳播途徑
        1.1.4 JEV病毒的多樣性
        1.1.5 JEV病毒的臨床癥狀
        1.1.6 JEV病毒的理化特性
        1.1.7 JEV病毒的基因組結(jié)構(gòu)及編碼蛋白質(zhì)
        1.1.8 黃病毒的結(jié)構(gòu)蛋白及其功能
    1.2 JEV病毒的復(fù)制由蛋白相互作用調(diào)控
        1.2.1 非結(jié)構(gòu)蛋白與胞內(nèi)蛋白作用調(diào)控病毒復(fù)制
        1.2.2 非結(jié)構(gòu)蛋白相互作用調(diào)控病毒復(fù)制
    1.3 黃病毒的反向遺傳學(xué)技術(shù)
        1.3.1 全長(zhǎng)感染性克隆
        1.3.2 亞基因組復(fù)制子
    1.4 實(shí)驗(yàn)?zāi)康呐c意義
2 材料與方法
    2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        2.1.1 實(shí)驗(yàn)器材
        2.1.2 細(xì)胞系、菌株、復(fù)制子、抗體
        2.1.3 試劑盒
    2.2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.2.1 VEEV-PAC-2A-JEV-Cpr ME克隆構(gòu)建
        2.2.2 VEEV-PAC-2 A-JEV-Cpr ME體外轉(zhuǎn)錄RNA
        2.2.3 細(xì)胞培養(yǎng)
        2.2.4 脂質(zhì)體DMRIE-C轉(zhuǎn)染RNA于BHK-21 細(xì)胞
        2.2.5 電轉(zhuǎn)RNA于BHK-21 細(xì)胞
        2.2.6 間接免疫熒光實(shí)驗(yàn) (Indirect Immunofluorescence Assay,IFA)
        2.2.7 熒光素酶Rluc活性檢測(cè)
3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
    3.1 體外轉(zhuǎn)錄JEV-Rluc復(fù)制子RNA
    3.2 JEV-NS5抗體驗(yàn)證
    3.3 JEV-Rluc RNA表達(dá)驗(yàn)證
    3.4 VEEV-JEV-Cpr ME RNA與JEV Replicon RNA互補(bǔ)驗(yàn)證
    3.5 VEEV-PAC-2A-JEV-Cpr ME克隆構(gòu)建
        3.5.1 PAC-2A和JEV-Cpr ME基因擴(kuò)增
        3.5.2 PAC-2A和JEV-Cpr ME基因融合
        3.5.3 片段與載體雙酶切
        3.5.4 菌液PCR鑒定
    3.6 體外轉(zhuǎn)錄VEEV-PAC-2A-JEV-Cpr ME RNA
    3.7 VEEV-PAC-2A-JEV-Cpr ME RNA的表達(dá)驗(yàn)證
    3.8 VEEV-PAC-2A-JEV-Cpr ME RNA與JEV Replicon RNA互補(bǔ)驗(yàn)證
    3.9 電轉(zhuǎn)順次轉(zhuǎn)染RNA可提高JEV VLPs產(chǎn)量
    3.10 JEV-Cpr ME細(xì)胞系的篩選
4 討論
5 結(jié)論
致謝
參考文獻(xiàn)
攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文



本文編號(hào)：3784320