目的構(gòu)建抗結(jié)核MPT64-Ag85B/katG/GNLY-PRF1重組質(zhì)粒DNA疫苗。方法利用DNA重組技術(shù),將激活細(xì)胞免疫和體液免疫的MPT64/Ag85B優(yōu)勢(shì)抗原基因和野生型katG基因編碼區(qū)以及穿孔素/顆粒溶素整合進(jìn)串聯(lián)真核表達(dá)載體pIRES2-EGFP中,構(gòu)建抗結(jié)核重組質(zhì)粒MPT64-Ag85B/katG/GNLY-PRF1;電轉(zhuǎn)化方法將質(zhì)粒重組恥垢分枝桿菌制備菌苗;通過(guò)脂質(zhì)體Lipofectamine 2000介導(dǎo)將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。應(yīng)用qRT-PCR技術(shù)在mRNA水平檢測(cè)靶基因體外表達(dá)效果并用Western blot方法檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞是否表達(dá)目的蛋白。結(jié)果 PCR證實(shí)重組質(zhì)粒MPT64-Ag85B/katG/GNLYPRF1構(gòu)建成功并制備重組恥垢分枝桿菌菌苗;qRT-PCR分析表明重組質(zhì)粒的靶基因MPT64/Ag85B、katG、GNLY/PRFl基因轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后均有表達(dá),免疫印跡分析重組質(zhì)粒的融合蛋白MPT64/Ag85B在相對(duì)分子質(zhì)量72 kDa處有明顯蛋白表達(dá)條帶,且融合蛋白MPT64/Ag85B可分泌表達(dá);融合蛋白GNLY/PRF在相對(duì)分子質(zhì)量75 kD...

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【文章目錄】：
1 材料與方法
    1.1 材料
        1.1.1 細(xì)胞株、菌株和載體
        1.1.2 試劑與主要儀器
    1.2 實(shí)驗(yàn)方法
        1.2.1 質(zhì)粒構(gòu)建
        1.2.2 重組恥垢分枝桿菌菌苗的構(gòu)建
            1.2.2. 1 電轉(zhuǎn)化
            1.2.2. 2 菌液PCR進(jìn)行基因型鑒定
            1.2.2. 3 制備菌苗
        1.2.3 293T細(xì)胞轉(zhuǎn)染
        1.2.4 Real-Time RT-PCR
        1.2.5 Western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染后蛋白表達(dá)
    1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
2 結(jié)果
    2.1 質(zhì)粒構(gòu)建
    2.2 重組恥垢分枝桿菌菌苗的構(gòu)建
    2.3 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞結(jié)果效果分析
    2.4 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人源胚腎293T細(xì)胞中靶基因在mRNA水平上表達(dá)
    2.5 Western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染后蛋白表達(dá)情況
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