為了探索NS1不同位點(diǎn)突變對流感病毒毒力的影響以及NS1毒力相關(guān)位點(diǎn)的作用機(jī)制。分析流感病毒NS1蛋白的毒力相關(guān)關(guān)鍵基因區(qū)段和關(guān)鍵位點(diǎn),以實(shí)驗(yàn)室保存的H1N1亞型流感病毒PR8F為模板,對其NS1基因的第42、81、149位氨基酸分別進(jìn)行定點(diǎn)突變。利用反向遺傳操作技術(shù),成功拯救出突變毒株P(guān)R8F-42、PR8F-81、PR8F-149。將獲救病毒接種SPF雞胚,連續(xù)傳代5代,至病毒能夠穩(wěn)定擴(kuò)增后,通過血凝效價分析病毒復(fù)制效率。并將獲救病毒與PR8F均以106 TCID50/100μL感染BALB/c小鼠,觀察各組小鼠臨床表現(xiàn)、體重變化及存活率。剖檢攻毒后死亡小鼠,觀察病理特征,制作肺組織病理切片。并提取小鼠肺臟RNA,通過qPCR檢測各組小鼠肺臟的病毒載量。結(jié)果表明,PR8F的NS1蛋白第42位氨基酸由絲氨酸(Ser)改變?yōu)楦彼?Pro)對小鼠的致病性無明顯改變。第81位、149位氨基酸突變則都能減弱突變株對小鼠的致病性,進(jìn)而為研究NS1毒力相關(guān)位點(diǎn)的作用機(jī)制提供平臺。

【文章頁數(shù)】：7 頁

【文章目錄】：
材料與方法
    1病毒株與細(xì)胞系
    2主要試劑及實(shí)驗(yàn)設(shè)備
    3雞胚及實(shí)驗(yàn)動物
    4 NS不同位點(diǎn)突變質(zhì)粒的構(gòu)建
        4.1突變引物的設(shè)計(jì)
        4.2 PCR的體系與條件
        4.3 PCR產(chǎn)物的消化
        4.4轉(zhuǎn)化
        4.5突變質(zhì)粒測序鑒定
    5 PR8F流感病毒突變株的拯救
    6拯救病毒的擴(kuò)增及鑒定
        6.1拯救病毒感染MDCK細(xì)胞及傳代
        6.2拯救病毒的血凝效價測定
        6.3拯救病毒的TCID50測定
    7 PR8F各突變病毒對BALB/C小鼠致病性的比較
        7.1在SPF雞胚中的擴(kuò)增
        7.2感染BALB/c小鼠
        7.3樣品采集與處理
        7.4 QPCR檢測各突變病毒在感染小鼠肺臟內(nèi)的病毒載量
結(jié)果
    1病毒的TCID50及血凝效價
    2小鼠剖檢結(jié)果
    3肺組織病變差異分析
    4小鼠感染不同位點(diǎn)突變病毒后體重變化
    5不同位點(diǎn)突變病毒對小鼠的致死率
    6小鼠感染各突變病毒后肺臟內(nèi)的病毒載量比較
討論



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