本文關鍵詞：腸道細菌O多糖結合疫苗生物合成研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：痢疾和霍亂都是重要的腸道傳染病,其病原體分別為志賀氏菌(Shigella Spp.)和霍亂弧菌(Vibrio Cholerae)。對痢疾和霍亂的治療多依賴抗生素,但抗生素的長期使用會導致細菌的耐藥性增加,也容易出現(xiàn)多重耐藥菌株。接種疫苗是最經(jīng)濟和有效的預防手段,但目前還未研發(fā)成功預防細菌性痢疾的安全有效疫苗,預防霍亂也多用針對O1群的重組B亞單位/霍亂菌體疫苗,O139群尚無預防性疫苗。開展多糖結合疫苗的研究具有重要意義。利用多糖的免疫原性制備的多糖疫苗屬于T細胞非依賴性抗原,其免疫過程中沒有T細胞的參與,也不形成免疫記憶,產生的抗體親和力較低。將細菌的多糖與適當?shù)牡鞍纵d體結合而形成的糖蛋白疫苗屬于T細胞依賴性抗原,能引起T、B細胞的聯(lián)合識別,明顯提高免疫效果,還可形成免疫記憶。蛋白糖基化過程與細菌脂多糖的合成具有很大的相似性,細菌具有糖基化修飾功能,pgl基因簇表達糖基轉移酶的發(fā)現(xiàn),這些都使得O多糖與蛋白載體在細菌體內結合為糖蛋白成為了可能。生物法合成糖蛋白疫苗成本低,操作簡單,只需要一步純化工作即可得到所需糖蛋白;由于糖基化位點明確,其制備的糖蛋白均一性好,方便質量控制。本研究利用實驗室前期構建的福氏2a志賀氏菌301 waa I缺失突變株,轉入含有腦膜炎奈瑟球菌蛋白糖基化途徑中寡糖基轉移酶(Pgl L)的表達載體,以及含有霍亂毒素B亞單位(cholera toxin B subunit,CTB)的表達載體,使該重組菌在誘導條件下,形成了以痢疾OPS(O-specific polysaccharides)為目標抗原、以CTB為載體蛋白的痢疾OPS-CTB糖蛋白復合物。接下來利用底物蛋白自身的性質以及所帶有的His標簽,經(jīng)過親和層析與離子交換層析,最終得到痢疾多糖結合蛋白的純化樣品,并驗證了糖蛋白的存在形式為聚體狀態(tài)。之后對糖蛋白純化產物進行免疫原性評價,選取小鼠作為實驗動物,用2.5μg量的純化后糖蛋白對其進行免疫,并用OPS組、佐劑組分別做對照,用間接ELISA法檢測小鼠血清抗體滴度來探究其免疫原性。ELISA測定血清抗體滴度顯示,CTB作為載體蛋白能有效增加糖鏈的免疫原性;糖蛋白刺激小鼠生成了Ig G1、Ig G2a、Ig G2b和Ig G3抗體,其中主要為Ig G1抗體;糖蛋白可導致機體同時產生細胞免疫應答和體液免疫應答,且以體液免疫應答為主。最后對免疫后的各組小鼠進行攻毒實驗,以最小致死量作為攻毒劑量,觀察一周后結果顯示,OPS組、佐劑組、空白組小鼠全部死亡,糖蛋白組各有小鼠存活,由此說明免疫小鼠后血清中的抗痢疾OPS的Ig G為保護性抗體,CTB-OPS糖蛋白作為疫苗對于機體抵御志賀氏菌的侵襲有一定的保護能力。本研究利用生物合成法成功制備了痢疾O多糖蛋白結合疫苗候選株。此外,本實驗還發(fā)現(xiàn),將糖基化系統(tǒng)導入未敲除waa I基因的野生株內,經(jīng)誘導后其也能表達糖蛋白,雖然此糖蛋白與waa I缺失株表達的糖蛋白的糖型略有差異,但在免疫小鼠后引起的血清效價中,兩組之間并無明顯的差異。這為之后的研究提供了一個新的思路,在不容易敲除基因的菌株中,可以先不敲除基因,而是嘗試導入糖基化系統(tǒng),看其是否可在野生株表達。本實驗采用自殺載體p WM91與細菌基因組重組的方法,成功構建了霍亂O139群93-3菌株waa L基因缺失株;之后,對所構建的菌株進行生理生化特征研究,結果表明waa L的缺失對細菌的生長幾乎沒有影響。缺失株的構建,為下一步將糖基轉移酶和底物蛋白克隆到此菌株中并獲得針對霍亂弧菌O139群的糖蛋白疫苗奠定了基礎。
【關鍵詞】：多糖結合疫苗 福氏2a志賀氏菌 O抗原連接酶 霍亂弧菌 基因敲除
【學位授予單位】：中國食品藥品檢定研究院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R392

  本文關鍵詞：腸道細菌O多糖結合疫苗生物合成研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

，

本文編號：376031