本文關(guān)鍵詞：腸道細(xì)菌O多糖結(jié)合疫苗生物合成研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：痢疾和霍亂都是重要的腸道傳染病,其病原體分別為志賀氏菌(Shigella Spp.)和霍亂弧菌(Vibrio Cholerae)。對(duì)痢疾和霍亂的治療多依賴抗生素,但抗生素的長期使用會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌的耐藥性增加,也容易出現(xiàn)多重耐藥菌株。接種疫苗是最經(jīng)濟(jì)和有效的預(yù)防手段,但目前還未研發(fā)成功預(yù)防細(xì)菌性痢疾的安全有效疫苗,預(yù)防霍亂也多用針對(duì)O1群的重組B亞單位/霍亂菌體疫苗,O139群尚無預(yù)防性疫苗。開展多糖結(jié)合疫苗的研究具有重要意義。利用多糖的免疫原性制備的多糖疫苗屬于T細(xì)胞非依賴性抗原,其免疫過程中沒有T細(xì)胞的參與,也不形成免疫記憶,產(chǎn)生的抗體親和力較低。將細(xì)菌的多糖與適當(dāng)?shù)牡鞍纵d體結(jié)合而形成的糖蛋白疫苗屬于T細(xì)胞依賴性抗原,能引起T、B細(xì)胞的聯(lián)合識(shí)別,明顯提高免疫效果,還可形成免疫記憶。蛋白糖基化過程與細(xì)菌脂多糖的合成具有很大的相似性,細(xì)菌具有糖基化修飾功能,pgl基因簇表達(dá)糖基轉(zhuǎn)移酶的發(fā)現(xiàn),這些都使得O多糖與蛋白載體在細(xì)菌體內(nèi)結(jié)合為糖蛋白成為了可能。生物法合成糖蛋白疫苗成本低,操作簡單,只需要一步純化工作即可得到所需糖蛋白;由于糖基化位點(diǎn)明確,其制備的糖蛋白均一性好,方便質(zhì)量控制。本研究利用實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建的福氏2a志賀氏菌301 waa I缺失突變株,轉(zhuǎn)入含有腦膜炎奈瑟球菌蛋白糖基化途徑中寡糖基轉(zhuǎn)移酶(Pgl L)的表達(dá)載體,以及含有霍亂毒素B亞單位(cholera toxin B subunit,CTB)的表達(dá)載體,使該重組菌在誘導(dǎo)條件下,形成了以痢疾OPS(O-specific polysaccharides)為目標(biāo)抗原、以CTB為載體蛋白的痢疾OPS-CTB糖蛋白復(fù)合物。接下來利用底物蛋白自身的性質(zhì)以及所帶有的His標(biāo)簽,經(jīng)過親和層析與離子交換層析,最終得到痢疾多糖結(jié)合蛋白的純化樣品,并驗(yàn)證了糖蛋白的存在形式為聚體狀態(tài)。之后對(duì)糖蛋白純化產(chǎn)物進(jìn)行免疫原性評(píng)價(jià),選取小鼠作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,用2.5μg量的純化后糖蛋白對(duì)其進(jìn)行免疫,并用OPS組、佐劑組分別做對(duì)照,用間接ELISA法檢測(cè)小鼠血清抗體滴度來探究其免疫原性。ELISA測(cè)定血清抗體滴度顯示,CTB作為載體蛋白能有效增加糖鏈的免疫原性;糖蛋白刺激小鼠生成了Ig G1、Ig G2a、Ig G2b和Ig G3抗體,其中主要為Ig G1抗體;糖蛋白可導(dǎo)致機(jī)體同時(shí)產(chǎn)生細(xì)胞免疫應(yīng)答和體液免疫應(yīng)答,且以體液免疫應(yīng)答為主。最后對(duì)免疫后的各組小鼠進(jìn)行攻毒實(shí)驗(yàn),以最小致死量作為攻毒劑量,觀察一周后結(jié)果顯示,OPS組、佐劑組、空白組小鼠全部死亡,糖蛋白組各有小鼠存活,由此說明免疫小鼠后血清中的抗痢疾OPS的Ig G為保護(hù)性抗體,CTB-OPS糖蛋白作為疫苗對(duì)于機(jī)體抵御志賀氏菌的侵襲有一定的保護(hù)能力。本研究利用生物合成法成功制備了痢疾O多糖蛋白結(jié)合疫苗候選株。此外,本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn),將糖基化系統(tǒng)導(dǎo)入未敲除waa I基因的野生株內(nèi),經(jīng)誘導(dǎo)后其也能表達(dá)糖蛋白,雖然此糖蛋白與waa I缺失株表達(dá)的糖蛋白的糖型略有差異,但在免疫小鼠后引起的血清效價(jià)中,兩組之間并無明顯的差異。這為之后的研究提供了一個(gè)新的思路,在不容易敲除基因的菌株中,可以先不敲除基因,而是嘗試導(dǎo)入糖基化系統(tǒng),看其是否可在野生株表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)采用自殺載體p WM91與細(xì)菌基因組重組的方法,成功構(gòu)建了霍亂O139群93-3菌株waa L基因缺失株;之后,對(duì)所構(gòu)建的菌株進(jìn)行生理生化特征研究,結(jié)果表明waa L的缺失對(duì)細(xì)菌的生長幾乎沒有影響。缺失株的構(gòu)建,為下一步將糖基轉(zhuǎn)移酶和底物蛋白克隆到此菌株中并獲得針對(duì)霍亂弧菌O139群的糖蛋白疫苗奠定了基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：多糖結(jié)合疫苗 福氏2a志賀氏菌 O抗原連接酶 霍亂弧菌 基因敲除
【學(xué)位授予單位】：中國食品藥品檢定研究院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R392

  本文關(guān)鍵詞：腸道細(xì)菌O多糖結(jié)合疫苗生物合成研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

，

本文編號(hào)：376031