異種移植,是指將有活力的細胞、器官、組織進行種間移植,有望成為緩解同種移植中人源器官資源短缺的有效途徑。出于器官大小、生理相容性和倫理道德方面的考慮,豬被認為是最合適的異種移植供體。然而,豬內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒(Porcine endogenous retrovirus, PERV)可以由正常的豬源細胞釋放,有關(guān)PERV體外感染人源細胞系和體內(nèi)感染重度聯(lián)合免疫缺陷(severe combined immunodeficiency, SCID)小鼠有關(guān)組織的發(fā)現(xiàn),引起人們對臨床上異種移植病原安全性的擔憂,即帶有PERV的豬源細胞、組織、器官移植到病人體內(nèi),是否會引發(fā)人獸共患病的流行或?qū)е掳┌Y的發(fā)生?鑒于人免疫系統(tǒng)缺陷病病毒(Human immunodeficiency virus, HIV)和嚴重急性呼吸系統(tǒng)綜合癥冠狀病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus, SRAS-CoV)等一系列動物源性病毒所帶來的威脅,有關(guān)PERV在異種移植中的感染性和對PERV的病原安全性進行系統(tǒng)評價成為了這一領(lǐng)域研究的熱點。 雖然在接受豬源細胞、組織和器官...

【文章頁數(shù)】：87 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
縮略詞表（Abbreviation）
中文摘要
英文摘要
前言
材料與方法
    1. 材料
    2.P ERV- WZSP- env基因的擴增與克隆
        2.1 PERV-WZSP-env序列分析
        2.2 PERV-WZSP-env基因引物設(shè)計與合成
        2.3 外周血單個核細胞的分離
        2.4 PBMC 總RNA的提取
        2.5 反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈
        2.6 PCR擴增產(chǎn)物的克隆與鑒定
        2.7 pHCMV-env重組表達質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定
    3. 重組反轉(zhuǎn)錄病毒載體的構(gòu)建
        3.1 MSCVneo-GFP的構(gòu)建策略
        3.2 GFP基因引物設(shè)計與合成
        3.3 PCR擴增GFP片段
        3.4 目的片段的純化、回收
        3.5 反轉(zhuǎn)錄病毒載體MSCVneo雙酶切及GFP連接
        3.6 反轉(zhuǎn)錄病毒載體的鑒定
    4. 整合PERV囊膜的假型鼠白血病病毒的包裝
        4.1 HEK293T細胞培養(yǎng)
        4.2 菌液擴大培養(yǎng)
        4.3 質(zhì)粒DNA的中量提取及純化
        4.4 假型反轉(zhuǎn)錄病毒的包裝
        4.5 轉(zhuǎn)染細胞基因組中env基因整合及轉(zhuǎn)錄情況的檢測
        4.6 病毒濃縮
        4.7 假型病毒感染性的檢測
        4.8 流式細胞儀測定假型反轉(zhuǎn)錄病毒的滴度
    5.P ERV細胞感染譜分析
        5.1 細胞培養(yǎng)
        5.2 細胞感染實驗
        5.3 細胞感染譜分析
結(jié)果
    1. 五指山豬PERV-env核酸序列比對與進化分析結(jié)果
        1.1 五指山豬PERV-env核酸序列比對結(jié)果
        1.2 五指山豬PERV-Env氨基酸序列進化分析結(jié)果
    2.P ERV-env基因擴增、克隆及鑒定結(jié)果
        2.1 PERV-env基因的PCR擴增結(jié)果
        2.2 pGEM-T-env重組質(zhì)粒的鑒定結(jié)果與初步分析
        2.3 pHCMV-env表達質(zhì)粒的鑒定結(jié)果
    3.p MSCVneo-GFP的構(gòu)建與鑒定結(jié)果
        3.1 GFP基因PCR擴增結(jié)果
        3.2 重組反轉(zhuǎn)錄病毒載體pMSCVneo-GFP的構(gòu)建及鑒定
    4. 假型反轉(zhuǎn)錄病毒包裝結(jié)果
        4.1 包裝質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293T細胞結(jié)果
        4.2 轉(zhuǎn)染細胞中env基因的整合及轉(zhuǎn)錄情況的檢測結(jié)果
        4.3 假型病毒粒子的濃縮及鑒定
        4.4 假型病毒粒子感染性的檢測
        4.5 假型反轉(zhuǎn)錄病毒滴度測定結(jié)果
    5. 細胞感染譜的獲得及分析
        5.1 假型反轉(zhuǎn)錄病毒感染多種細胞結(jié)果
        5.2 PERV-WZSP感染譜分析
討論
    1. 關(guān)于PERV的體外宿主范圍細胞嗜性
    2. 關(guān)于PERV-WZSP-A囊膜化的假型鼠干細胞病毒包裝
    3. 關(guān)于PERV-WZSP-A細胞感染譜
    4.P ERV-Env關(guān)鍵區(qū)域的比對結(jié)果
結(jié)論
參考文獻
文獻綜述
    參考文獻
附錄
個人簡歷
致謝



本文編號：3757255