異種移植,是指將有活力的細(xì)胞、器官、組織進(jìn)行種間移植,有望成為緩解同種移植中人源器官資源短缺的有效途徑。出于器官大小、生理相容性和倫理道德方面的考慮,豬被認(rèn)為是最合適的異種移植供體。然而,豬內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒(Porcine endogenous retrovirus, PERV)可以由正常的豬源細(xì)胞釋放,有關(guān)PERV體外感染人源細(xì)胞系和體內(nèi)感染重度聯(lián)合免疫缺陷(severe combined immunodeficiency, SCID)小鼠有關(guān)組織的發(fā)現(xiàn),引起人們對(duì)臨床上異種移植病原安全性的擔(dān)憂,即帶有PERV的豬源細(xì)胞、組織、器官移植到病人體內(nèi),是否會(huì)引發(fā)人獸共患病的流行或?qū)е掳┌Y的發(fā)生?鑒于人免疫系統(tǒng)缺陷病病毒(Human immunodeficiency virus, HIV)和嚴(yán)重急性呼吸系統(tǒng)綜合癥冠狀病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus, SRAS-CoV)等一系列動(dòng)物源性病毒所帶來的威脅,有關(guān)PERV在異種移植中的感染性和對(duì)PERV的病原安全性進(jìn)行系統(tǒng)評(píng)價(jià)成為了這一領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。 雖然在接受豬源細(xì)胞、組織和器官...

【文章頁數(shù)】：87 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
縮略詞表（Abbreviation）
中文摘要
英文摘要
前言
材料與方法
    1. 材料
    2.P ERV- WZSP- env基因的擴(kuò)增與克隆
        2.1 PERV-WZSP-env序列分析
        2.2 PERV-WZSP-env基因引物設(shè)計(jì)與合成
        2.3 外周血單個(gè)核細(xì)胞的分離
        2.4 PBMC 總RNA的提取
        2.5 反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈
        2.6 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的克隆與鑒定
        2.7 pHCMV-env重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定
    3. 重組反轉(zhuǎn)錄病毒載體的構(gòu)建
        3.1 MSCVneo-GFP的構(gòu)建策略
        3.2 GFP基因引物設(shè)計(jì)與合成
        3.3 PCR擴(kuò)增GFP片段
        3.4 目的片段的純化、回收
        3.5 反轉(zhuǎn)錄病毒載體MSCVneo雙酶切及GFP連接
        3.6 反轉(zhuǎn)錄病毒載體的鑒定
    4. 整合PERV囊膜的假型鼠白血病病毒的包裝
        4.1 HEK293T細(xì)胞培養(yǎng)
        4.2 菌液擴(kuò)大培養(yǎng)
        4.3 質(zhì)粒DNA的中量提取及純化
        4.4 假型反轉(zhuǎn)錄病毒的包裝
        4.5 轉(zhuǎn)染細(xì)胞基因組中env基因整合及轉(zhuǎn)錄情況的檢測(cè)
        4.6 病毒濃縮
        4.7 假型病毒感染性的檢測(cè)
        4.8 流式細(xì)胞儀測(cè)定假型反轉(zhuǎn)錄病毒的滴度
    5.P ERV細(xì)胞感染譜分析
        5.1 細(xì)胞培養(yǎng)
        5.2 細(xì)胞感染實(shí)驗(yàn)
        5.3 細(xì)胞感染譜分析
結(jié)果
    1. 五指山豬PERV-env核酸序列比對(duì)與進(jìn)化分析結(jié)果
        1.1 五指山豬PERV-env核酸序列比對(duì)結(jié)果
        1.2 五指山豬PERV-Env氨基酸序列進(jìn)化分析結(jié)果
    2.P ERV-env基因擴(kuò)增、克隆及鑒定結(jié)果
        2.1 PERV-env基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果
        2.2 pGEM-T-env重組質(zhì)粒的鑒定結(jié)果與初步分析
        2.3 pHCMV-env表達(dá)質(zhì)粒的鑒定結(jié)果
    3.p MSCVneo-GFP的構(gòu)建與鑒定結(jié)果
        3.1 GFP基因PCR擴(kuò)增結(jié)果
        3.2 重組反轉(zhuǎn)錄病毒載體pMSCVneo-GFP的構(gòu)建及鑒定
    4. 假型反轉(zhuǎn)錄病毒包裝結(jié)果
        4.1 包裝質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞結(jié)果
        4.2 轉(zhuǎn)染細(xì)胞中env基因的整合及轉(zhuǎn)錄情況的檢測(cè)結(jié)果
        4.3 假型病毒粒子的濃縮及鑒定
        4.4 假型病毒粒子感染性的檢測(cè)
        4.5 假型反轉(zhuǎn)錄病毒滴度測(cè)定結(jié)果
    5. 細(xì)胞感染譜的獲得及分析
        5.1 假型反轉(zhuǎn)錄病毒感染多種細(xì)胞結(jié)果
        5.2 PERV-WZSP感染譜分析
討論
    1. 關(guān)于PERV的體外宿主范圍細(xì)胞嗜性
    2. 關(guān)于PERV-WZSP-A囊膜化的假型鼠干細(xì)胞病毒包裝
    3. 關(guān)于PERV-WZSP-A細(xì)胞感染譜
    4.P ERV-Env關(guān)鍵區(qū)域的比對(duì)結(jié)果
結(jié)論
參考文獻(xiàn)
文獻(xiàn)綜述
    參考文獻(xiàn)
附錄
個(gè)人簡(jiǎn)歷
致謝



本文編號(hào)：3757255