[目的]在HEK293細胞中表達人凝血因子Ⅶ（human coagulation factor,hFⅦ）蛋白。[方法]通過PCR分別擴增與hFⅦ羧基化有關的酶（γ-谷氨�；然福℅GCX）和維生素K環(huán)氧化物還原酶復合體亞單位1（VKORC1））基因序列,與hFⅦ基因片段構建真核表達載體p CAEVKORC1-GGCX-hFⅦ,利用脂質體將表達載體轉入HEK293細胞,采用Western blotting和ELISA方法檢測細胞上清中hFⅦ的表達水平,凝血因子Ⅶ檢測試劑盒測定hFⅦ的促凝血活性。[結果]Western blotting檢測細胞上清中含有hFⅦ蛋白,經(jīng)ELISA檢測表達量為12 mg/L,凝血因子Ⅶ檢測試劑盒測定hFⅦ的促凝血相對比活性為612%。[結論]該表達載體成功在HEK293細胞中瞬時表達hFⅦ蛋白,為進一步深入研究hFⅦ的生物學特性奠定了基礎。 

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【文章目錄】：
1 材料和方法
    1.1 質粒菌株及細胞
    1.2 主要試劑及儀器
    1.3 小鼠GGCX和VKORC1基因的克隆及鑒定
    1.4 重組表達質粒pCAE-VKORC1-GGCX-hFⅦ的構建
    1.5 重組質粒轉染細胞HEK293
    1.6 細胞培養(yǎng)上清中hFⅦ的Western blotting檢測
    1.7 細胞培養(yǎng)上清中hFⅦ的ELISA檢測
    1.8 細胞培養(yǎng)上清中hFⅦ的凝血活性分析
2 結果
    2.1 小鼠GGCX和VKORC1基因的克隆及鑒定
    2.2 重組質粒pCAE-VKORC-GGCX-hFⅦ的制備
        2.2.1 重組質粒pCAGGS-IRES-GGCX的鑒定
        2.2.2 重組質粒p CAGGS-VKORC1-IRES-GGCX的鑒定
        2.2.3 重組質粒pEE12.4-hFⅦ的鑒定
        2.2.4 重組質粒pCAE-VKORC1-GGCX-hFⅦ的鑒定
    2.3 重組人凝血因子Ⅶ蛋白的Western blotting鑒定
    2.4 ELISA檢測細胞上清中的hFⅦ含量
    2.5 凝固法分析細胞培養(yǎng)上清中hFⅦ的凝血活性
3 討論



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