發(fā)布時(shí)間：2022-12-11 01:18

　　[目的]在HEK293細(xì)胞中表達(dá)人凝血因子Ⅶ（human coagulation factor,hFⅦ）蛋白。[方法]通過(guò)PCR分別擴(kuò)增與hFⅦ羧基化有關(guān)的酶（γ-谷氨�；然福℅GCX）和維生素K環(huán)氧化物還原酶復(fù)合體亞單位1（VKORC1））基因序列,與hFⅦ基因片段構(gòu)建真核表達(dá)載體p CAEVKORC1-GGCX-hFⅦ,利用脂質(zhì)體將表達(dá)載體轉(zhuǎn)入HEK293細(xì)胞,采用Western blotting和ELISA方法檢測(cè)細(xì)胞上清中hFⅦ的表達(dá)水平,凝血因子Ⅶ檢測(cè)試劑盒測(cè)定hFⅦ的促凝血活性。[結(jié)果]Western blotting檢測(cè)細(xì)胞上清中含有hFⅦ蛋白,經(jīng)ELISA檢測(cè)表達(dá)量為12 mg/L,凝血因子Ⅶ檢測(cè)試劑盒測(cè)定hFⅦ的促凝血相對(duì)比活性為612%。[結(jié)論]該表達(dá)載體成功在HEK293細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)hFⅦ蛋白,為進(jìn)一步深入研究hFⅦ的生物學(xué)特性奠定了基礎(chǔ)。 

【文章頁(yè)數(shù)】：5 頁(yè)

【文章目錄】：
1 材料和方法
    1.1 質(zhì)粒菌株及細(xì)胞
    1.2 主要試劑及儀器
    1.3 小鼠GGCX和VKORC1基因的克隆及鑒定
    1.4 重組表達(dá)質(zhì)粒pCAE-VKORC1-GGCX-hFⅦ的構(gòu)建
    1.5 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞HEK293
    1.6 細(xì)胞培養(yǎng)上清中hFⅦ的Western blotting檢測(cè)
    1.7 細(xì)胞培養(yǎng)上清中hFⅦ的ELISA檢測(cè)
    1.8 細(xì)胞培養(yǎng)上清中hFⅦ的凝血活性分析
2 結(jié)果
    2.1 小鼠GGCX和VKORC1基因的克隆及鑒定
    2.2 重組質(zhì)粒pCAE-VKORC-GGCX-hFⅦ的制備
        2.2.1 重組質(zhì)粒pCAGGS-IRES-GGCX的鑒定
        2.2.2 重組質(zhì)粒p CAGGS-VKORC1-IRES-GGCX的鑒定
        2.2.3 重組質(zhì)粒pEE12.4-hFⅦ的鑒定
        2.2.4 重組質(zhì)粒pCAE-VKORC1-GGCX-hFⅦ的鑒定
    2.3 重組人凝血因子Ⅶ蛋白的Western blotting鑒定
    2.4 ELISA檢測(cè)細(xì)胞上清中的hFⅦ含量
    2.5 凝固法分析細(xì)胞培養(yǎng)上清中hFⅦ的凝血活性
3 討論



本文編號(hào)：3717872