研究目的： 構(gòu)建靶向自噬促進／結(jié)核分枝桿菌持留期抗原雙相治療性DNA疫苗,使之能在MΦ中特異性表達IRGM1蛋白以及編碼結(jié)核分枝桿菌持留期抗原,為后續(xù)在分子、細胞以及動物水平研究其抗結(jié)核感染的效果和機制奠定基礎(chǔ),以期克服結(jié)核病潛伏感染、多重耐藥和再燃等治療難題。 研究方法： 1.利用PCR方法擴增IRGM1、Rv1733c、Rv2031c、Rv2626c基因,再分別克隆至質(zhì)粒載體pET-32a（+）中。擴增MΦ特異性啟動子序列SP107替換掉雙啟動子真核共表達質(zhì)粒pBudCE4.1的啟動子CMV,將其改造成pBudSP。所有重組質(zhì)粒經(jīng)酶切鑒定正確后,送測序。測序正確后,依照次序,先將IRGM1基因片段亞克隆入pBudSP中SP107啟動子下游的Sal Ⅰ/BamH I位點中形成pBudSP-L,再將Rv1733c/Rv2031c/Rv2626c基因分別亞克隆入pBudSP-L中EF-1α[啟動子下游的Not Ⅰ/Kpn I位點中,形成MΦ特異性真核雙表達質(zhì)粒pBudSP-L-1733c/2031c/2626co 2.利用PCR方法,以質(zhì)粒pERLO為模版擴增RF... 

【文章頁數(shù)】：89 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
目錄
符號說明
第1章 引言
第2章 治療性DNA疫苗pBudSP-L-1733c/2031c/2626c的構(gòu)建及鑒定
    2.1 材料和方法
        2.1.1 材料
        2.1.2 方法
    2.2 結(jié)果
        2.2.1 質(zhì)粒pBudSP的構(gòu)建及鑒定
        2.2.2 質(zhì)粒pET32a(+)-IRGM1和pET32a(+)-1733c/2031c/2626c的構(gòu)建及鑒定
        2.2.3 質(zhì)粒pBudSP-L-1733c/2031c/2626c的構(gòu)建及鑒定
    2.3 討論
    2.4 小結(jié)
第3章 熒光蛋白融合表達載體的構(gòu)建及鑒定
    3.1 材料和方法
        3.1.1 材料
        3.1.2 方法
    3.2 結(jié)果
        3.2.1 質(zhì)粒pCDNA3.1(+)-RFP的構(gòu)建及鑒定
        3.2.2 質(zhì)粒pET32a(+)-IRGM1②的構(gòu)建及鑒定
        3.2.3 質(zhì)粒pBudSP-LR-1733c/2031c/2626c的構(gòu)建及表達鑒定
        3.2.4 FuGENE HD轉(zhuǎn)染后熒光觀察
        3.2.5 pCDNA3.1(-)-1733②的構(gòu)建及鑒定
        3.2.6 pET32a(+)-GFP的構(gòu)建及鑒定
        3.2.7 pBudSP-LR-1733G的構(gòu)建及鑒定
        3.2.8 電轉(zhuǎn)染后熒光觀察
        3.2.9 RQ-PCR檢測目的基因RNA水平表達
        3.2.10 質(zhì)粒pBudCE-RFP的構(gòu)建及鑒定
        3.2.11 啟動子SP107的特異性檢測
    3.3 討論
    3.4 小結(jié)
第4章 結(jié)論
    4.1 概述
    4.2 主要研究結(jié)論
    4.3 本課題的創(chuàng)新之處
致謝
參考文獻
攻讀學位期間的研究成果
綜述
    參考文獻


【參考文獻】：
期刊論文
[1]革蘭陰性菌基因敲除載體的構(gòu)建及其應(yīng)用[J]. 王景,穆媛媛,黎庶,陳志瑾,熊坤,叢延廣.  第三軍醫(yī)大學學報. 2009(23)



本文編號：3716628