眾所周知,E3泛素連接酶通過對蛋白的泛素化修飾,從而在先天免疫和適應性免疫調(diào)控中發(fā)揮重要作用。Cbl蛋白家族是一類具有RING-finger結(jié)構(gòu)域的E3泛素連接酶,在許多物種中都是高度保守的,主要由酪氨酸激酶結(jié)合結(jié)構(gòu)域（tyrosine kinase binding domain,PTB）、環(huán)指結(jié)構(gòu)域（RING finger domain）、脯氨酸富集區(qū)（a proline-rich region）和一段連接區(qū)域構(gòu)成,在哺乳動物中主要有三個成員:c-Cbl,Cbl-b和Cbl-c,在其造血系統(tǒng)中主要表達Cbl-b和c-Cbl。到目前為止已有大量的證據(jù)證明這兩個分子在淋巴細胞的發(fā)育和活化中起著重要的作用,且與Cbl相關(guān)的信號通路在細胞的增殖、分化以及細胞形態(tài)中都發(fā)揮著巨大的作用。巨噬細胞是造血系統(tǒng)中可塑性最強的免疫細胞,存在于所有的組織中,并且具有極強的功能多樣性。在機體發(fā)育、自身穩(wěn)定、損傷修復及免疫應答中均發(fā)揮很重要的作用。通過骨髓嵌合體的實驗研究發(fā)現(xiàn):當給野生型（WT）和Cbl-b敲除（Cbl-b-/-）小鼠注射巰基乙酸鹽后,Cbl-b-/-敲除小鼠腹膜中巨噬細胞的招募能力增強;也有... 

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【學位級別】：碩士

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中文摘要
Abstract
第一章 前言
第二章 實驗材料和方法
    2.1 實驗材料
        2.1.1 分子生物學試劑
        2.1.2 細胞培養(yǎng)相關(guān)試劑及材料
        2.1.3 抗體和細胞因子
        2.1.4 小鼠
        2.1.5 主要實驗儀器
        2.1.6 相關(guān)引物
    2.2 實驗方法
        2.2.1.基因組DNA抽提與鑒定：（從小鼠尾巴中抽提全基因組DNA）
        2.2.2.骨髓單個懸浮細胞的制備
        2.2.3.BMDM的培養(yǎng)
        2.2.4.細胞表面染色：用于流式分析
        2.2.5 流式細胞分選
        2.2.6.Western blot
        2.2.7 免疫磁珠分選
        2.2.8 RNA抽提
        2.2.9 cDNA的制備
        2.2.10 實時熒光定量PCR
        2.2.11 質(zhì)粒構(gòu)建
        2.2.12 膠回收
        2.2.13 限制性酶切
        2.2.14 感受態(tài)細菌的制備和質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化
        2.2.15 質(zhì)粒DNA小量抽取
        2.2.16 質(zhì)粒DNA大量抽取
        2.2.17 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染
        2.2.18 免疫共沉淀
        2.2.19 石蠟切片制備
        2.2.20 蘇木素-伊紅(H&E)染色
        2.2.21 天狼猩紅染色
        2.2.22 免疫熒光染色
        2.2.23 劉氏染色法
        2.2.24 銀染
        2.2.25 Brdu染色檢測細胞增殖
        2.2.26 Annexin V染色檢測細胞凋亡
第三章 Cbl /c-Cbl在巨噬細胞中雙敲除的小鼠模型的建立與鑒定
    3.1 巨噬細胞活化后Cbl-b和c-Cbl的表達量升高
    3.2 巨噬細胞中c-Cbl/Cbl-b雙敲除小鼠模型的建立與鑒定
        3.2.1 c-Cbl/Cbl-b敲除小鼠的PCR鑒定
        3.2.2 c-Cbl/Cbl-b敲除小鼠的Western blot鑒定
    3.3 小結(jié)
第四章 Cbl-b/c-Cbl在巨噬細胞中雙敲除小鼠的表型分析
    4.1 Cbl-b/c-Cbl雙敲除小鼠生存曲線
    4.2 Cbl-b/c-Cbl雙敲除小鼠肺損傷及其鑒定
    4.3 雙敲除小鼠肺灌洗液中肺泡巨噬細胞的表型分析
    4.4 雙敲除小鼠肺灌洗液中其他免疫細胞的表型分析
    4.5 雙敲除小鼠脾臟和胸腺中T細胞的表型分析
    4.6 雙敲除小鼠脾臟和骨髓中B細胞的表型分析
    4.7 雙敲除小鼠脾臟和骨髓中DC的表型分析
    4.8 雙敲除小鼠脾臟和骨髓中粒細胞的表型分析
    4.9 雙敲除小鼠脾臟和骨髓中巨噬細胞的表型分析
    4.10 雙敲除小鼠血液中單核細胞和粒細胞的表型分析
    4.11 雙敲除小鼠肺泡巨噬細胞的活化
    4.12 雙敲除小鼠肺泡巨噬細胞的增殖和凋亡
    4.13 雙敲除小鼠肺灌洗液中細胞因子及趨化因子受體的檢測
    4.14 雙敲除小鼠肺泡巨噬細胞會誘導WT小鼠肺損傷
    4.15 小結(jié)
第五章 Cbl-b/c-Cbl對巨噬細胞炎癥調(diào)控的機制研究
    5.1 雙敲除Cbl-b/c-Cbl會影響PU.1 對M-CSFR的轉(zhuǎn)錄調(diào)控
        5.1.1 WT、Cbl-b KO、c-Cbl KO和dKO四種小鼠的BMDM體外擴增
        5.1.2 WT、Cbl-b KO、c-Cbl KO和dKO四種小鼠的肺灌洗液中M-CSFR的表達情況
        5.1.3 M-CSFR與Cbl-b/c-Cbl的相互作用
        5.1.4 體外驗證PU.1 與Cbl-b/c-Cbl的相互作用
    5.2 雙敲除Cbl-b/c-Cbl影響巨噬細胞中Lyn及其下游信號分子的表達
        5.2.1 質(zhì)譜法檢測肺泡巨噬細胞中與Cbl-b/c-Cbl相互作用的分子
        5.2.2 肺灌洗液以及BMDM中檢測Lyn與SHIP1的表達
        5.2.3 SHIP1與Cbl-b/c-Cbl相互作用
        5.2.4 Lyn與Cbl-b/c-Cbl相互作用
        5.2.5 抑制Lyn的表達會影響dKO小鼠BMDM中炎癥因子及趨化因子受體的表達
        5.2.6 Lyn下游信號分子的相關(guān)表達
        5.2.7 小結(jié)
第六章 討論
參考文獻
綜述 巨噬細胞在特發(fā)性肺纖維化中的作用機制及研究進展
    參考文獻
英文縮寫
致謝



本文編號：3703040