本研究旨在探討晚期糖基化白蛋白（advanced glycated albumin, AGE-alb）對(duì)巨噬細(xì)胞核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3 （nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3, NLRP3）-caspase-1途徑的影響,以闡明AGE-alb對(duì)巨噬細(xì)胞焦亡的影響及機(jī)制。體外培養(yǎng)RAW264.7巨噬細(xì)胞,分別給予AGE-alb （1、2、4和6 g/L）、對(duì)照白蛋白（C-alb,4 g/L）處理24h或以NLRP3抑制劑MCC950 （1μmol/L）預(yù)處理細(xì)胞,1h后以AGE-alb（4g/L）處理24h。MTT法檢測細(xì)胞活力,試劑盒測定caspase-1和培養(yǎng)基乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase, LDH）活性以及白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β, IL-1β）、IL-18濃度,TUNEL法和Hoechst 33342/PI雙染法檢測細(xì)胞死亡情況,Westernblot分析NLRP3、procaspase-1和cleavedcaspase-1表達(dá)... 

【文章來源】：生理學(xué)報(bào). 2019,71(06)北大核心CSCD

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MCC950抑制AGE-alb誘導(dǎo)的caspase-1活化和IL-1β、IL-18分泌

細(xì)胞焦亡是受炎性小體調(diào)控的依賴于caspase-1和(或)caspase-4/5/11的新型程序性細(xì)胞死亡方式。炎性小體是一類多蛋白復(fù)合物，可識(shí)別來源于入侵病原體的病原體相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular patterns,PAMP)和內(nèi)源性應(yīng)激誘導(dǎo)的危險(xiǎn)相關(guān)分子模式(danger-associated molecular patterns,DAMP)。典型的炎性小體屬于核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體(nucleotide-binding oligomerization domainlike receptor,NLR)家族，由C-端富含亮氨酸的重復(fù)序列(leucine-rich repeats,LRR)、中段核苷酸結(jié)合寡聚結(jié)構(gòu)域(nucleotide-binding oligomerization,NOD/NACHT)和N-端半胱氨酸蛋白酶激活和募集結(jié)構(gòu)域(caspase activation and recruitment domain,CARD)或pyrin結(jié)構(gòu)域(pyrin domains,PYD)組成[18]。文獻(xiàn)報(bào)道AS高風(fēng)險(xiǎn)(如吸煙、高血壓、高膽固醇、糖尿病)患者主動(dòng)脈壁內(nèi)炎性小體表達(dá)水平顯著上調(diào)[19]。NLRP3是研究最為廣泛的一種炎性小體，病原體入侵時(shí)或在高糖、高脂等因素的刺激下，通過PAMP和DAMP的作用而被激活。NLRP3活化后其PYD與下游凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing a caspase activation and recruitment domain,ASC)結(jié)合并募集caspase-1前體(procaspase-1)，使其自身水解加工成p10和p20亞基，產(chǎn)生具有酶活性的caspase-1(cleaved caspase-1)，后者剪切IL-β和IL-18促進(jìn)其成熟并釋放到細(xì)胞外，細(xì)胞腫脹，誘發(fā)細(xì)胞焦亡[20]。文獻(xiàn)報(bào)道NLRP3在人頸動(dòng)脈和冠狀動(dòng)脈粥樣斑塊尤其巨噬源性泡沫細(xì)胞中表達(dá)明顯增加，且與AS嚴(yán)重程度及預(yù)后相關(guān)[7,8]，而NLRP3基因沉默或NLRP3抑制劑MCC950不僅可減少促炎因子生成，延緩AS進(jìn)展，還能降低斑塊基質(zhì)金屬蛋白酶活性，增加平滑肌和膠原纖維含量，增強(qiáng)斑塊穩(wěn)定性[21,22]，表明NLRP3在AS發(fā)生、發(fā)展及易損斑塊形成中具有重要作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，AGE-alb處理巨噬細(xì)胞后，NLRP3表達(dá)上調(diào)，且隨AGE-alb濃度的增加而增加。Caspase-1是介導(dǎo)經(jīng)典細(xì)胞焦亡途徑的關(guān)鍵因子。內(nèi)外源性刺激因素通過不同途徑激活炎性小體進(jìn)而活化caspase-1，介導(dǎo)細(xì)胞膜小孔形成，細(xì)胞滲透性腫脹破裂，細(xì)胞內(nèi)容物流出以及IL-1β、IL-18等促炎因子成熟和釋放[20]。在因急性心血管事件死亡的患者冠狀動(dòng)脈易損和破裂斑塊中caspase-1水平顯著增加[23]。ox-LDL和膽固醇結(jié)晶可激活NLRP3和caspase-1誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞焦亡，而沉默/敲除NLRP3和caspase-1則抑制ox-LDL和膽固醇結(jié)晶誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞裂解、DNA斷裂及IL-1β和IL-18的生成，并可降低高脂飼養(yǎng)的Apo E-/-小鼠AS斑塊炎癥因子表達(dá)和單核細(xì)胞募集，減輕AS病變[9–11,21,24]。本研究結(jié)果顯示，AGE-alb可濃度依賴性地增加巨噬細(xì)胞caspase-1活性，而給予NLRP3特異性抑制劑MCC950預(yù)處理，可明顯抑制AGE-alb所誘導(dǎo)的caspase-1活化、IL-1β和IL-18釋放、細(xì)胞活力降低和LDH漏出，并減少TUNEL陽性和PI陽性細(xì)胞數(shù)，表明NLRP3-caspase-1途徑是介導(dǎo)AGE-alb所致巨噬細(xì)胞焦亡的重要機(jī)制之一。

與正常對(duì)照組比較，C-alb組巨噬細(xì)胞NLRP3蛋白水平無明顯改變(P>0.05)，而AGE-alb(2、4和6 g/L)則顯著上調(diào)NLRP3表達(dá)(P<0.01，圖3)。圖2.AGE-alb促進(jìn)IL-1β和IL-18分泌

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]活化轉(zhuǎn)錄因子6-C/EBP同源蛋白途徑介導(dǎo)晚期糖基化白蛋白誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞凋亡[J]. 康攀攀,姚樹桐,郭甜甜,王志超,田華,焦鵬,周健,秦樹存.  生理學(xué)報(bào). 2017(06)
[2]胰島素增強(qiáng)糖基化白蛋白對(duì)大鼠血管平滑肌細(xì)胞的促增殖作用(英文)[J]. 何榕,曲愛娟,毛節(jié)明,王憲,孫威.  生理學(xué)報(bào). 2007(01)



本文編號(hào)：3620865