本研究旨在探討晚期糖基化白蛋白（advanced glycated albumin, AGE-alb）對巨噬細胞核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3 （nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3, NLRP3）-caspase-1途徑的影響,以闡明AGE-alb對巨噬細胞焦亡的影響及機制。體外培養(yǎng)RAW264.7巨噬細胞,分別給予AGE-alb （1、2、4和6 g/L）、對照白蛋白（C-alb,4 g/L）處理24h或以NLRP3抑制劑MCC950 （1μmol/L）預處理細胞,1h后以AGE-alb（4g/L）處理24h。MTT法檢測細胞活力,試劑盒測定caspase-1和培養(yǎng)基乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase, LDH）活性以及白細胞介素-1β（interleukin-1β, IL-1β）、IL-18濃度,TUNEL法和Hoechst 33342/PI雙染法檢測細胞死亡情況,Westernblot分析NLRP3、procaspase-1和cleavedcaspase-1表達... 

【文章來源】：生理學報. 2019,71(06)北大核心CSCD

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【部分圖文】：

MCC950抑制AGE-alb誘導的caspase-1活化和IL-1β、IL-18分泌

細胞焦亡是受炎性小體調控的依賴于caspase-1和(或)caspase-4/5/11的新型程序性細胞死亡方式。炎性小體是一類多蛋白復合物，可識別來源于入侵病原體的病原體相關分子模式(pathogen-associated molecular patterns,PAMP)和內源性應激誘導的危險相關分子模式(danger-associated molecular patterns,DAMP)。典型的炎性小體屬于核苷酸結合寡聚化結構域樣受體(nucleotide-binding oligomerization domainlike receptor,NLR)家族，由C-端富含亮氨酸的重復序列(leucine-rich repeats,LRR)、中段核苷酸結合寡聚結構域(nucleotide-binding oligomerization,NOD/NACHT)和N-端半胱氨酸蛋白酶激活和募集結構域(caspase activation and recruitment domain,CARD)或pyrin結構域(pyrin domains,PYD)組成[18]。文獻報道AS高風險(如吸煙、高血壓、高膽固醇、糖尿病)患者主動脈壁內炎性小體表達水平顯著上調[19]。NLRP3是研究最為廣泛的一種炎性小體，病原體入侵時或在高糖、高脂等因素的刺激下，通過PAMP和DAMP的作用而被激活。NLRP3活化后其PYD與下游凋亡相關斑點樣蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing a caspase activation and recruitment domain,ASC)結合并募集caspase-1前體(procaspase-1)，使其自身水解加工成p10和p20亞基，產生具有酶活性的caspase-1(cleaved caspase-1)，后者剪切IL-β和IL-18促進其成熟并釋放到細胞外，細胞腫脹，誘發(fā)細胞焦亡[20]。文獻報道NLRP3在人頸動脈和冠狀動脈粥樣斑塊尤其巨噬源性泡沫細胞中表達明顯增加，且與AS嚴重程度及預后相關[7,8]，而NLRP3基因沉默或NLRP3抑制劑MCC950不僅可減少促炎因子生成，延緩AS進展，還能降低斑塊基質金屬蛋白酶活性，增加平滑肌和膠原纖維含量，增強斑塊穩(wěn)定性[21,22]，表明NLRP3在AS發(fā)生、發(fā)展及易損斑塊形成中具有重要作用。本實驗結果顯示，AGE-alb處理巨噬細胞后，NLRP3表達上調，且隨AGE-alb濃度的增加而增加。Caspase-1是介導經典細胞焦亡途徑的關鍵因子。內外源性刺激因素通過不同途徑激活炎性小體進而活化caspase-1，介導細胞膜小孔形成，細胞滲透性腫脹破裂，細胞內容物流出以及IL-1β、IL-18等促炎因子成熟和釋放[20]。在因急性心血管事件死亡的患者冠狀動脈易損和破裂斑塊中caspase-1水平顯著增加[23]。ox-LDL和膽固醇結晶可激活NLRP3和caspase-1誘導巨噬細胞焦亡，而沉默/敲除NLRP3和caspase-1則抑制ox-LDL和膽固醇結晶誘導的巨噬細胞裂解、DNA斷裂及IL-1β和IL-18的生成，并可降低高脂飼養(yǎng)的Apo E-/-小鼠AS斑塊炎癥因子表達和單核細胞募集，減輕AS病變[9–11,21,24]。本研究結果顯示，AGE-alb可濃度依賴性地增加巨噬細胞caspase-1活性，而給予NLRP3特異性抑制劑MCC950預處理，可明顯抑制AGE-alb所誘導的caspase-1活化、IL-1β和IL-18釋放、細胞活力降低和LDH漏出，并減少TUNEL陽性和PI陽性細胞數，表明NLRP3-caspase-1途徑是介導AGE-alb所致巨噬細胞焦亡的重要機制之一。

與正常對照組比較，C-alb組巨噬細胞NLRP3蛋白水平無明顯改變(P>0.05)，而AGE-alb(2、4和6 g/L)則顯著上調NLRP3表達(P<0.01，圖3)。圖2.AGE-alb促進IL-1β和IL-18分泌

【參考文獻】：
期刊論文
[1]活化轉錄因子6-C/EBP同源蛋白途徑介導晚期糖基化白蛋白誘導的巨噬細胞凋亡[J]. 康攀攀,姚樹桐,郭甜甜,王志超,田華,焦鵬,周健,秦樹存.  生理學報. 2017(06)
[2]胰島素增強糖基化白蛋白對大鼠血管平滑肌細胞的促增殖作用(英文)[J]. 何榕,曲愛娟,毛節(jié)明,王憲,孫威.  生理學報. 2007(01)



本文編號：3620865