目的:構(gòu)建幽門螺桿菌（Hp）毒力蛋白cagA基因敲除突變株并進(jìn)行鑒定。方法:采用基因打靶技術(shù),從Hp1004基因組擴(kuò)增cagA基因的上、下游同源重組臂序列,從pACYC184質(zhì)粒上擴(kuò)增氯霉素（Cm）序列,通過融合聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）技術(shù)獲得cagA基因敲除打靶片段,克隆入載體pUCmT,得到打靶載體pUCmT-ΔcagA::Cm;再通過電轉(zhuǎn)化法將pUCmT-ΔcagA::Cm質(zhì)粒直接轉(zhuǎn)入Hp1004,氯霉素抗性平板篩選cagA基因敲除株并命名為Hp/ΔcagA::Cm;采用PCR進(jìn)行鑒定,并用Hp/ΔcagA::Cm和Hp/cagA感染原代胃癌細(xì)胞,檢測胞內(nèi)cagA的表達(dá)和對細(xì)胞形態(tài)的影響。結(jié)果:融合PCR構(gòu)建打靶片段長度為1 794 bp,打靶載體轉(zhuǎn)化Hp并篩選后,用cagA外側(cè)引物PCR擴(kuò)增Hp/ΔcagA::Cm和野生型Hp/cagA,產(chǎn)物長度分別為2 150 bp和5 014 bp;Hp/ΔcagA::Cm和Hp/cagA分別感染細(xì)胞后,細(xì)胞死亡數(shù)量多于感染Hp/ΔcagA::Cm突變株,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<001）;野生型Hp/cagA菌株及其感染細(xì)胞內(nèi)cagA蛋... 

【文章來源】：貴州醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào). 2020,45(02)

【文章頁數(shù)】：7 頁

【部分圖文】：

Hp/ΔcagA::Cm和Hp/cagA感染細(xì)胞形態(tài)改變（100×）

cagA基因上、下游同源重組臂經(jīng)設(shè)計(jì)與Cm抗性基因序列有部分重疊，可通過PCR直接融合，獲得全長的打靶片段，長度為1 794 bp，見圖1。2.2 Hp/ΔcagA::Cm突變株P(guān)CR鑒定

PCR擴(kuò)增鑒定結(jié)果顯示，Hp/ΔcagA::Cm陽性克隆擴(kuò)增產(chǎn)物為2 150 bp，野生型Hp/cagA菌株擴(kuò)增產(chǎn)物為5 014 bp，表明成功獲得Hp/ΔcagA::Cm敲出突變菌株，見圖2。2.3 Hp/ΔcagA::Cm和Hp/cagA感染的原代胃癌細(xì)胞形態(tài)

【參考文獻(xiàn)】：
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