目的:構建幽門螺桿菌（Hp）毒力蛋白cagA基因敲除突變株并進行鑒定。方法:采用基因打靶技術,從Hp1004基因組擴增cagA基因的上、下游同源重組臂序列,從pACYC184質(zhì)粒上擴增氯霉素（Cm）序列,通過融合聚合酶鏈式反應（PCR）技術獲得cagA基因敲除打靶片段,克隆入載體pUCmT,得到打靶載體pUCmT-ΔcagA::Cm;再通過電轉化法將pUCmT-ΔcagA::Cm質(zhì)粒直接轉入Hp1004,氯霉素抗性平板篩選cagA基因敲除株并命名為Hp/ΔcagA::Cm;采用PCR進行鑒定,并用Hp/ΔcagA::Cm和Hp/cagA感染原代胃癌細胞,檢測胞內(nèi)cagA的表達和對細胞形態(tài)的影響。結果:融合PCR構建打靶片段長度為1 794 bp,打靶載體轉化Hp并篩選后,用cagA外側引物PCR擴增Hp/ΔcagA::Cm和野生型Hp/cagA,產(chǎn)物長度分別為2 150 bp和5 014 bp;Hp/ΔcagA::Cm和Hp/cagA分別感染細胞后,細胞死亡數(shù)量多于感染Hp/ΔcagA::Cm突變株,差異有統(tǒng)計學意義（P<001）;野生型Hp/cagA菌株及其感染細胞內(nèi)cagA蛋... 

【文章來源】：貴州醫(yī)科大學學報. 2020,45(02)

【文章頁數(shù)】：7 頁

【部分圖文】：

Hp/ΔcagA::Cm和Hp/cagA感染細胞形態(tài)改變（100×）

cagA基因上、下游同源重組臂經(jīng)設計與Cm抗性基因序列有部分重疊，可通過PCR直接融合，獲得全長的打靶片段，長度為1 794 bp，見圖1。2.2 Hp/ΔcagA::Cm突變株PCR鑒定

PCR擴增鑒定結果顯示，Hp/ΔcagA::Cm陽性克隆擴增產(chǎn)物為2 150 bp，野生型Hp/cagA菌株擴增產(chǎn)物為5 014 bp，表明成功獲得Hp/ΔcagA::Cm敲出突變菌株，見圖2。2.3 Hp/ΔcagA::Cm和Hp/cagA感染的原代胃癌細胞形態(tài)

【參考文獻】：
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本文編號：3619933