目的克隆并原核表達C2株藍氏賈第鞭毛蟲（Giardia lambia,簡稱賈第蟲）末端結(jié)合蛋白1（End-binding protein 1,geb1）基因,獲得重組gEB1蛋白。方法由于geb1基因無內(nèi)含子,我們以C2株賈第蟲基因組為模板,以國際標準株WB株geb1基因序列為參考序列,設(shè)計引物克隆geb1基因,經(jīng)NcoⅠ和XhoⅠ雙酶切與原核表達載體p ET-28α（+）連接,轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coli TOP10,經(jīng)篩選和測序驗證后導(dǎo)入大腸桿菌E.coli Rosetta（DE3）,異丙基-β-D-硫代半乳糖（IPTG）誘導(dǎo)gEB1蛋白表達,產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE和Western blot進行檢測和驗證。結(jié)果成功構(gòu)建了表達C2株賈第蟲geb1基因的原核表達載體pET-28α（+）-gEB1,轉(zhuǎn)化入大腸桿菌E.coli Rosetta（DE3）,重組菌株經(jīng)0.1 mmol/L IPTG,30℃低溫誘導(dǎo)5 h,SDS-PAGE和Western blot顯示,在相對分子量約29 KDa的位置出現(xiàn)目的蛋白條帶,與理論值一致。結(jié)論用大腸桿菌成功表達了gEB1蛋白,為gEB1蛋白的功能研究和抗體制... 

【文章來源】：熱帶病與寄生蟲學(xué). 2020,18(01)

【文章頁數(shù)】：4 頁

【部分圖文】：

geb1基因PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳分析

目的基因經(jīng)雙酶切后與pET-28α(+)相連，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.Coli TOP10，陽性克隆提取質(zhì)粒后經(jīng)Nco I和Xho I雙酶切鑒定，電泳分別可見約760 bp的geb1基因目的片段、約5 300 bp的載體pET-28α(+)兩條電泳條帶(圖2)，與預(yù)期結(jié)果一致，將進一步測序驗證正確的質(zhì)粒命名為p ET-28α(+)-gEB1。3 geb1基因的誘導(dǎo)表達和鑒定

重組質(zhì)粒pET-28α(+)-gEB1轉(zhuǎn)化E.coli Rosetta(DE3),0.1 m M IPTG誘導(dǎo)表達5 h，并將所得產(chǎn)物煮沸裂解進行SDS-PAGE實驗，以未誘導(dǎo)的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌作為對照，SDS-PAGE驗證重組蛋白的表達結(jié)果(圖3)。結(jié)果顯示誘導(dǎo)菌在分子量29 kDa處有出現(xiàn)一條明顯的條帶，而未誘導(dǎo)菌沒有此條帶，與預(yù)期相符合(圖4)。Western blot確認此條帶確為gEB1-His Tag融合蛋白。圖4 geb1基因融合蛋白Western blot分析

【參考文獻】：
期刊論文
[1]C2株藍氏賈第鞭毛蟲cDNA文庫的構(gòu)建[J]. 劉紹偉,王洋,田喜鳳.  河北醫(yī)科大學(xué)學(xué)報. 2018(01)
[2]藍氏賈第鞭毛蟲α-4賈第素誘餌蛋白質(zhì)粒構(gòu)建[J]. 劉紹偉,王洋,田喜鳳.  華北理工大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版). 2017(06)
[3]藍氏賈第鞭毛蟲單克隆抗體的制備及鑒定[J]. 章樂生,孫磊,胡媛,鞏文詞,王燕娟,沈玉娟,徐馀信,汪天平,曹建平.  中國寄生蟲學(xué)與寄生蟲病雜志. 2017(02)

碩士論文
[1]pSupper1300-EB1c-GFP重組質(zhì)粒的構(gòu)建及轉(zhuǎn)基因植株的篩選[D]. 劉佳雨.山西師范大學(xué) 2016



本文編號：3564614