第一部分一個新microRNA的克隆及其在破骨細胞分化過程中作用的研究目的：篩選新的小鼠破骨細胞特異性表達或優(yōu)勢表達的microRNA,研究其在小鼠體內不同組織和細胞的表達譜及在破骨細胞分化過程中的作用。方法：將小鼠原代成骨細胞與骨髓細胞共同培養(yǎng)獲得原代破骨細胞,分離并克隆細胞內所有小RNA,并與已知的小RNA進行比對鑒定了一個新的microRNA,提交miRBase數(shù)據(jù)庫注冊后命名為miR-9718;應用Northern Blot測定小鼠不同組織及細胞miR-9718的表達情況；用M-CSF聯(lián)合RANKL誘導RAW264.7細胞向破骨細胞分化,用Northern Blot及qRT-PCR測定miR-9718在RAW264.7細胞向破骨細胞分化過程中的表達模式；用pSilencer4.1-CMV載體構建miR-9718表達載體pre-miR-9718,并轉染RAW264.7細胞,建立miR-9718過表達細胞模型,加入RANKL及M-CSF誘導其向破骨細胞分化,提取細胞總RNA用qRT-PCR法測定破骨細胞特異性標記物TRAP及NFATc1的mRNA表達水平,并行TRAP染色觀察破骨細... 

【文章來源】：中南大學湖南省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：79 頁

【學位級別】：博士

【部分圖文】：

miR-9718在小鼠不同組織和細胞中的表達譜

圖3 miR-9718在RAW264.7細胞向破骨細胞分化過程中的表達模式注：左圖為用NorthemBlot檢測miR-9718表達，同一張膜經(jīng)洗脫后檢測內參U6表達。右圖為qRT-PCR檢測niiR-9718表達，用其與IJ6表達量的比值表示。

0 i2h 24h 48h圖3 miR-9718在RAW264.7細胞向破骨細胞分化過程中的表達模式左圖為用NorthemBlot檢測miR-9718表達，同一張膜經(jīng)洗脫后檢測內參U6表達。右圖為qRT-PCR檢測niiR-9718表達，用其與IJ6表達量的比值表示。表達miR-9718對RA\V264.7細胞向破骨細胞分化的影響pre-miR-9718轉染后iniR-9718表達水平的變化為了研究miR-9718在破骨細胞分化過程中的作用，我們構建了 miR-9718達載體(pre-niiR-9718)，并將其穩(wěn)定轉染RAW264.7細胞，提取細胞總RNAorthern Blot檢測轉染前后miR-9718表達水平，以U6作為內對照。之前的已經(jīng)證實在轉染前，RAW264.7細胞中無miR-9718表達。結果顯示與轉染-C空載體的對照組相比，pre-miR-9718轉染后的RAW264.7細胞中miR-9718明顯升高（圖4),證實pre-miR-9718載體構建成功，且轉染pre-miR-9718RAW264.7細胞可以穩(wěn)定地過表達miR-9718。CO

【參考文獻】：
期刊論文
[1]One Decade of Development and Evolution of MicroRNA Target Prediction Algorithms[J]. Paula H.Reyes～Herrera,Elisa Ficarra.  Genomics, Proteomics & Bioinformatics. 2012(05)



本文編號：3484384