asb5是ASB家族的成員之一,可能與動脈閉塞性疾病的發(fā)生有關(guān)。本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)asb5特異性地表達于人體的心臟和骨骼肌中,且在心臟中的表達較高,提示其可能與心臟和骨骼肌發(fā)育有關(guān),但目前對asb5基因的生物學功能未知。斑馬魚作為模式生物具有多種優(yōu)勢,例如體外受精、胚胎透明、發(fā)育過程可在顯微鏡下進行觀察、與人類基因組的同源性高達70%等。本研究以斑馬魚作為研究模型,構(gòu)建斑馬魚asb5基因敲除品系,為后續(xù)研究asb5基因的功能提供基礎(chǔ)。本研究通過跨越一個內(nèi)含子分別在兩個外顯子上各設(shè)計一個打靶位,即雙靶位點敲除的方式進行敲除工作。該方法相比于單個sgRNA介導(dǎo)的敲除,特異性更好,且能造成大片段的缺失,也易于后續(xù)的檢測。首先,對asb5基因的基本生物學信息進行初步分析表明,人類ASB5基因在斑馬魚中的同源基因有asbaa和asb5b,本研究則是以asb5a基因作為研究對象。首先分別在該基因的2號和3號外顯子上各設(shè)一個打靶位點,隨后在體外合成sgRNA,將其與Cas9mRNA共同顯微共注射到野生型斑馬魚一細胞期胚胎的細胞中。待胚胎發(fā)育至48小時后,進行打靶有效性分析,即選擇一定數(shù)量的胚胎提取... 

【文章來源】：湖南師范大學湖南省 211工程院校

【文章頁數(shù)】：55 頁

【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

ZFNs原理示意圖[36](圖片引自

系統(tǒng)分泌一類具有ＤＮＡ結(jié)合活性的蛋白質(zhì)，亦稱為類轉(zhuǎn)錄激活效ｓｃｒｉｐｔｉｏｎ?ａｃｔｉｖａｔｏｒ－ｌｉｋｅ?ｅｆｆｅｃｔｏｒｓ，?ＴＡＬＥ）?［４４］；?ＴＡＬＥ?進入宿主細胞的活相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄以逃避其免疫系統(tǒng)。如圖１－２所示，ＴＡＬＥ蛋白由構(gòu)域、中部的ＤＮＡ特異識別與結(jié)合結(jié)構(gòu)域、Ｃ端轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域組成［４５］。２０１０年，Ｃｈｒｉｓｔｉａ＃６４＃ＴＡＬＥ蛋白將Ｃ端的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)?Ｉ核酸內(nèi)切酶切割結(jié)構(gòu)域，即ＴＡＬＥＮｓ。ＴＡＬＥ蛋白的ＤＮＡ特異識域由該蛋白家族所特有的長的、串聯(lián)排列的重復(fù)序列組成，一個重個堿基。每個重復(fù)單元由３３？３５個氨基酸殘基組成，加上Ｃ端含有殘基的半重復(fù)單元即可識別一個特定的核苷酸靶位點。每個重復(fù)單位氨基酸殘基為重復(fù)可變雙殘基（Ｒｅｐｅａｔ?ｖａｒｉａｂｌｅ?ｄｉ－ｒｅｓｉｄｕｅ，ＲＶＤ）核苷酸序列的不同而改變，其余的氦基酸殘基則相對保守。ＲＶＤ的Ｉ、ＮＧ、ＨＤ、ＮＮ分別識別Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ四種堿基，而ＮＨ較ＮＮ高效，特異性也更強［４７］。??＇？

利用ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術(shù)構(gòu)建斑馬魚ＭＭａ基因敲除品系心臟中，該基因表達量最高，如圖１－８所示。使用ＥｘＰＡＳｙ的Ｐｒｏ該基因所編碼的氨基酸序列進行分析，可知斑馬魚所編碼的化性質(zhì)，也即該蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量約為３６ＫＤ，理論等電點為８．４６，性值為０．０３９，加上ＥｘＰＡＳｙ的ＰｒｏｔＳｃａｌｅ的疏水性分析，可知該蛋白。使用ＴＭＨＭＭ在線工具進行分析，結(jié)果如圖１－９所示，橫坐標個氨基酸的位置，縱坐標代表該區(qū)域為跨膜區(qū)域的可能性，紅線和外區(qū)域和膜內(nèi)區(qū)域，兩者交換位置表示此處經(jīng)過了跨膜，而從圖蛋白存在跨膜區(qū)域。用Ｐｈｙｒｅ２在線數(shù)據(jù)庫對鈣蛋白的三位結(jié)構(gòu)進如圖１－１０所示。??

【參考文獻】：
期刊論文
[1]CRISPR/Cas9系統(tǒng)作用機制及研究進展[J]. 艾元立,陳康軒,胡菲陽,閆學春,梁洋.  黑龍江畜牧獸醫(yī). 2017(07)
[2]先天性心臟病病因及發(fā)病機理的研究進展[J]. 李永鵬,周修明,都鵬飛.  安徽醫(yī)學. 2017(01)
[3]利用ZFN敲除轉(zhuǎn)基因豬細胞中多拷貝EGFP基因[J]. 任廣彩,張英,叢佩清,陳瑤生,何祖勇.  中國生物化學與分子生物學報. 2014(08)
[4]TALEN構(gòu)建與斑馬魚基因組定點突變的實驗方法與流程[J]. 沈延,黃鵬,張博.  遺傳. 2013(04)
[5]類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶（TALEN）介導(dǎo)的基因組定點修飾技術(shù)[J]. 沈延,肖安,黃鵬,王唯曄,朱作言,張博.  遺傳. 2013(04)
[6]TILLING技術(shù)原理及其應(yīng)用研究進展[J]. 王彩芬,安永平,張文銀,馬靜.  種子. 2011(09)
[7]利用Tol2轉(zhuǎn)座子構(gòu)建斑馬魚心臟組織特異表達轉(zhuǎn)基因載體及其表達分析[J]. 陳婷芳,羅娜,謝華平,吳秀山,鄧云.  生物工程學報. 2010(02)



本文編號：3481903