asb5是ASB家族的成員之一,可能與動(dòng)脈閉塞性疾病的發(fā)生有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)asb5特異性地表達(dá)于人體的心臟和骨骼肌中,且在心臟中的表達(dá)較高,提示其可能與心臟和骨骼肌發(fā)育有關(guān),但目前對(duì)asb5基因的生物學(xué)功能未知。斑馬魚作為模式生物具有多種優(yōu)勢(shì),例如體外受精、胚胎透明、發(fā)育過程可在顯微鏡下進(jìn)行觀察、與人類基因組的同源性高達(dá)70%等。本研究以斑馬魚作為研究模型,構(gòu)建斑馬魚asb5基因敲除品系,為后續(xù)研究asb5基因的功能提供基礎(chǔ)。本研究通過跨越一個(gè)內(nèi)含子分別在兩個(gè)外顯子上各設(shè)計(jì)一個(gè)打靶位,即雙靶位點(diǎn)敲除的方式進(jìn)行敲除工作。該方法相比于單個(gè)sgRNA介導(dǎo)的敲除,特異性更好,且能造成大片段的缺失,也易于后續(xù)的檢測(cè)。首先,對(duì)asb5基因的基本生物學(xué)信息進(jìn)行初步分析表明,人類ASB5基因在斑馬魚中的同源基因有asbaa和asb5b,本研究則是以asb5a基因作為研究對(duì)象。首先分別在該基因的2號(hào)和3號(hào)外顯子上各設(shè)一個(gè)打靶位點(diǎn),隨后在體外合成sgRNA,將其與Cas9mRNA共同顯微共注射到野生型斑馬魚一細(xì)胞期胚胎的細(xì)胞中。待胚胎發(fā)育至48小時(shí)后,進(jìn)行打靶有效性分析,即選擇一定數(shù)量的胚胎提取... 

【文章來源】：湖南師范大學(xué)湖南省 211工程院校

【文章頁(yè)數(shù)】：55 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

ZFNs原理示意圖[36](圖片引自

系統(tǒng)分泌一類具有ＤＮＡ結(jié)合活性的蛋白質(zhì)，亦稱為類轉(zhuǎn)錄激活效ｓｃｒｉｐｔｉｏｎ?ａｃｔｉｖａｔｏｒ－ｌｉｋｅ?ｅｆｆｅｃｔｏｒｓ，?ＴＡＬＥ）?［４４］；?ＴＡＬＥ?進(jìn)入宿主細(xì)胞的活相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄以逃避其免疫系統(tǒng)。如圖１－２所示，ＴＡＬＥ蛋白由構(gòu)域、中部的ＤＮＡ特異識(shí)別與結(jié)合結(jié)構(gòu)域、Ｃ端轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域組成［４５］。２０１０年，Ｃｈｒｉｓｔｉａ＃６４＃ＴＡＬＥ蛋白將Ｃ端的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)?Ｉ核酸內(nèi)切酶切割結(jié)構(gòu)域，即ＴＡＬＥＮｓ。ＴＡＬＥ蛋白的ＤＮＡ特異識(shí)域由該蛋白家族所特有的長(zhǎng)的、串聯(lián)排列的重復(fù)序列組成，一個(gè)重個(gè)堿基。每個(gè)重復(fù)單元由３３？３５個(gè)氨基酸殘基組成，加上Ｃ端含有殘基的半重復(fù)單元即可識(shí)別一個(gè)特定的核苷酸靶位點(diǎn)。每個(gè)重復(fù)單位氨基酸殘基為重復(fù)可變雙殘基（Ｒｅｐｅａｔ?ｖａｒｉａｂｌｅ?ｄｉ－ｒｅｓｉｄｕｅ，ＲＶＤ）核苷酸序列的不同而改變，其余的氦基酸殘基則相對(duì)保守。ＲＶＤ的Ｉ、ＮＧ、ＨＤ、ＮＮ分別識(shí)別Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ四種堿基，而ＮＨ較ＮＮ高效，特異性也更強(qiáng)［４７］。??＇？

利用ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術(shù)構(gòu)建斑馬魚ＭＭａ基因敲除品系心臟中，該基因表達(dá)量最高，如圖１－８所示。使用ＥｘＰＡＳｙ的Ｐｒｏ該基因所編碼的氨基酸序列進(jìn)行分析，可知斑馬魚所編碼的化性質(zhì)，也即該蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量約為３６ＫＤ，理論等電點(diǎn)為８．４６，性值為０．０３９，加上ＥｘＰＡＳｙ的ＰｒｏｔＳｃａｌｅ的疏水性分析，可知該蛋白。使用ＴＭＨＭＭ在線工具進(jìn)行分析，結(jié)果如圖１－９所示，橫坐標(biāo)個(gè)氨基酸的位置，縱坐標(biāo)代表該區(qū)域?yàn)榭缒^(qū)域的可能性，紅線和外區(qū)域和膜內(nèi)區(qū)域，兩者交換位置表示此處經(jīng)過了跨膜，而從圖蛋白存在跨膜區(qū)域。用Ｐｈｙｒｅ２在線數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)鈣蛋白的三位結(jié)構(gòu)進(jìn)如圖１－１０所示。??

【參考文獻(xiàn)】：
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本文編號(hào)：3481903