目的以RSV感染人神經(jīng)元細(xì)胞為基礎(chǔ),通過TLR4-siRNA手段沉默人神經(jīng)元SY5Y細(xì)胞中的TLR4受體,并給予適量褪黑素作用于RSV感染的SY5Y細(xì)胞,探究TLR4受體的激活和給予外源性褪黑素對RSV感染神經(jīng)元誘導(dǎo)NLRP3炎性小體的產(chǎn)生與促進(jìn)細(xì)胞自噬發(fā)生的調(diào)節(jié)作用以及褪黑素可能的保護(hù)機(jī)制,為臨床預(yù)防和治療RSV感染中樞神經(jīng)系統(tǒng)提供新的思路。方法首先以RSV體外感染SY5Y細(xì)胞,分別于感染后4、12、24和48h收集細(xì)胞和培養(yǎng)上清液,并設(shè)立不同的組別,以未感染的細(xì)胞作為對照組,判斷RSV感染對人神經(jīng)元細(xì)胞的NLRP3和自噬影響;再以不同TLR4-siRNA序列干擾SY5Y細(xì)胞TLR4受體,選擇最合適的沉默序列,設(shè)立TLR4-siRNA實驗組;最后用不同濃度梯度的褪黑素作用SY5Y細(xì)胞后,CCK8檢測神經(jīng)元活性情況,選取適宜濃度褪黑素設(shè)立為MT實驗組。（1）TCLD₅₀檢測病毒滴度;（2）酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測各組培養(yǎng)上清液中IL-1β、IL-18和TNF-α炎癥因子的表達(dá);（3）免疫印跡法（Western-blot）檢測各組不同時間點TLR4、NLRP... 

【文章來源】：安徽醫(yī)科大學(xué)安徽省

【文章頁數(shù)】：71 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

WesternBlot檢測si-R1和si-R2兩條序列的轉(zhuǎn)染效果

我們用 siRNA 沉默 TLR4 受體表達(dá)，用熒光顯微鏡檢測了不同時間點的。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染 SY5Y 細(xì)胞后 4h、12h、24h 和 48h 可見熒光標(biāo)記的綠并且該熒光隨沉默時間呈一定規(guī)律，有時間依賴性，24h 的轉(zhuǎn)染效率最tern Blot 的檢測結(jié)果一樣，見圖 2。同時我們提取 siRNA 沉默 TLR4 后和蛋白，使用 Western Blot 的方法檢測不同轉(zhuǎn)染時間的 TLR4 蛋白的表達(dá)情與熒光顯微鏡觀察到的結(jié)果一樣。見下圖 3。

結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染 SY5Y 細(xì)胞后 4h、12h、24h 和 48h 可見熒光標(biāo)記的綠色。并且該熒光隨沉默時間呈一定規(guī)律，有時間依賴性，24h 的轉(zhuǎn)染效率最高estern Blot 的檢測結(jié)果一樣，見圖 2。同時我們提取 siRNA 沉默 TLR4 后和時的蛋白，使用 Western Blot 的方法檢測不同轉(zhuǎn)染時間的 TLR4 蛋白的表達(dá)情況果與熒光顯微鏡觀察到的結(jié)果一樣。見下圖 3。圖 2 轉(zhuǎn)染 SY5Y 細(xì)胞后 4h、12h、24h 和 48h 可見熒光標(biāo)記的綠色熒光Fig2: Fluorescently labeled green fluorescence was observed at 4h, 12h, 24h and 48h aftertransfection of SY5Y cells.

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]褪黑素對大鼠肺缺血再灌注損傷的保護(hù)作用[J]. 張冰緣,朱琳,劉再英,武艷.  世界最新醫(yī)學(xué)信息文摘. 2018(24)
[2]褪黑素通過沉默信息調(diào)節(jié)因子1減輕線粒體氧化應(yīng)激對腦缺血-再灌注小鼠的作用[J]. 劉陽陽,梁國標(biāo),甄恩迪,毛崇丹,高旭,郝廣志,董玉書.  中國腦血管病雜志. 2017(10)
[3]自噬、自噬性細(xì)胞死亡與腫瘤的研究進(jìn)展[J]. 伍思霖,黃玉瑩,丁海林,顧曄,張曉彪.  生命科學(xué). 2017(08)
[4]褪黑素對大鼠急性脊髓損傷后自噬的影響[J]. 徐玉生,汪鑫,理陽,朱海洋,鐘斌,李鵬輝,蘇一帆.  醫(yī)藥論壇雜志. 2017(05)
[5]Ras/Raf/MEK/ERK信號通路參與自噬調(diào)控作用的研究進(jìn)展[J]. 王雪,張評滸.  中國藥科大學(xué)學(xué)報. 2017(01)
[6]Autophagic activity in neuronal cell death[J]. Robert W.Button,Shouqing Luo,David C.Rubinsztein.  Neuroscience Bulletin. 2015(04)
[7]有償獻(xiàn)血人群血漿IL-18水平與HCV感染及其基因型的相關(guān)性研究[J]. 薛興欣,蔡立,王佳佳,唐篩娣,喻榮彬,蘇靜,路滟,王潔,張云.  中華疾病控制雜志. 2014(07)
[8]Neuropeptide Y protects cerebral cortical neurons by regulating microglial immune function[J]. Qijun Li,Changzheng Dong,Wenling Li,Wei Bu,Jiang Wu,Wenqing Zhao.  Neural Regeneration Research. 2014(09)
[9]手足口病68例臨床分析[J]. 吳曉波.  中國小兒急救醫(yī)學(xué). 2006(06)
[10]手足口病200例臨床分析[J]. 王新強(qiáng),李靜,曲梅.  中國煤炭工業(yè)醫(yī)學(xué)雜志. 2001(03)

博士論文
[1]SIRT1通過線粒體自噬阻斷NLRP3炎癥小體活化和足細(xì)胞損傷[D]. 白咪.南京醫(yī)科大學(xué) 2016
[2]RSV誘導(dǎo)Hep2細(xì)胞自噬在病毒復(fù)制中的作用及其機(jī)制研究[D]. 李苗.河北醫(yī)科大學(xué) 2016



本文編號：3476340