目的利用昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)（Bac-to-Bac）表達(dá)KANSL1蛋白并進(jìn)行純化,同時(shí)驗(yàn)證該蛋白在體外對(duì)微管蛋白聚合的影響。方法構(gòu)建真核表達(dá)載體pFast-Bac-HTB-mCherry-KANSL1,轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞獲得重組穿梭質(zhì)粒（Bacmid）,用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染介導(dǎo)Bacmid進(jìn)入草地貪夜蛾細(xì)胞（Sf9 cell）,以產(chǎn)生可表達(dá)目的基因的重組桿狀病毒。隨后用此重組桿狀病毒感染并擴(kuò)增Sf9細(xì)胞使其大量表達(dá)His-mCherry-KANSL1融合蛋白。通過鎳柱親和層析對(duì)表達(dá)的His-mCherry-KANSL1融合蛋白進(jìn)行初步純化,再經(jīng)快速蛋白液相色譜（FPLC）進(jìn)一步純化,利用Western印跡、考馬斯亮藍(lán)染色鑒定目的蛋白的表達(dá)純化效果,最后通過體外微管聚合實(shí)驗(yàn)分析純化的KANSL1蛋白對(duì)微管蛋白聚合的影響。結(jié)果質(zhì)粒測(cè)序顯示,pFast-Bac-HTB-mCherry-KANSL1真核表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功;考馬斯亮藍(lán)染色、Western印跡表明純化得到正確的His-mCherry-KANSL1蛋白,體外微管聚合實(shí)驗(yàn)顯示KANSL1蛋白顯著促進(jìn)微管蛋白的聚合。結(jié)論成功構(gòu)... 

【文章來源】：軍事醫(yī)學(xué). 2019,43(11)北大核心

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【部分圖文】：

Western印跡檢測(cè)純化mCherryKANSL1融合蛋白

（6）：827-841.［14］FellerC，PrestelM，HartmannH，etal.TheMOFcontainingNSLcomplexassociatesgloballywithhousekeepinggenes，butactivatesonlyadefinedsubset［J］.NucleicAcidsRes，2012，40（4）：1509-1522.［15］GilissenC，HehirKwaJY，ThungDT，etal.Genomesequencingidentifiesmajorcausesofsevereintellectualdisability［J］.Nature，2014，511（7509）：344-347.（姜曉舜編輯2019-10-22收稿）圖7KANSL1蛋白對(duì)微管聚合影響的免疫熒光觀察（A）及微管數(shù)統(tǒng)計(jì)分析（B）與對(duì)照組相比，***P<0.001，n=3850

白。最后取3μl反應(yīng)液涂片，顯微鏡下隨機(jī)挑選20個(gè)視野，觀察統(tǒng)計(jì)微管數(shù)目。11.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用GraphPadPrism6.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)以xˉ±s表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2結(jié)果22.1KANSL1DNA片段的擴(kuò)增以小鼠腦組織cDNA為模板，根據(jù)NCBA查詢的KANSL1編碼序列合成上、下游引物后，PCR擴(kuò)增其編碼序列。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果顯示在3100bp位置克隆出特異條帶，與目的基因片段大小一致（圖1）。圖1KANSL1基因片段的PCR擴(kuò)增M.BM15000DNA標(biāo)志物；1.基因片段PCR產(chǎn)物22.2pFastBacHTBmCherryKANSL1重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和NotⅠ雙酶切后的pFastBacHTBmCherry載體和KANSL1PCR產(chǎn)物重組連接，轉(zhuǎn)化于感受態(tài)細(xì)胞E.coliDH5α，經(jīng)菌落PCR鑒定、DNA測(cè)序分析和質(zhì)粒抽提，初步獲得pFastBacHTBmCherryKANSL1陽性重組質(zhì)粒。提取質(zhì)粒再次通過雙酶切鑒定，在3100bp處有特異條帶，符合預(yù)期結(jié)果（圖2）。測(cè)序表明，重組質(zhì)粒插入的目的基因序列與NCBI中目的基因序列完全一致，即獲得重組陽性的pFastBacHTBmCherryKANSL1質(zhì)粒。圖2重組質(zhì)粒pFastBacHTBmCherryKANSL1雙酶切鑒定M.BM15000DNA標(biāo)志物；1.BamHⅠ和NotⅠ重組質(zhì)粒雙酶切pFastBacHTBmCherryKANSL12.3重組BacmidKANSL1的獲得將重組pFastBacHTBmCherryKANSL1轉(zhuǎn)化E.coliDH10Bac感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)藍(lán)白斑篩選，挑取白色菌落為模板，以pUC/M13為引物進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增的片段經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定（圖3），大小與預(yù)期848


本文編號(hào)：3439337