目的:構(gòu)建金黃色葡萄球菌（金葡菌）ΔagrB/D/C/Newman敲除株,分析agrB/D/C對Agr系統(tǒng)活性及金葡菌毒力的影響,為深入研究不同型別Agr系統(tǒng)對金黃色葡萄球菌的致病作用提供依據(jù).方法:利用同源重組技術(shù),以pBT2為敲除載體,構(gòu)建ΔagrB/D/C/Newman敲除株,檢測野生株和敲除株的溶血能力,色素形成能力,生物膜形成能力及毒力基因表達(dá).結(jié)果:成功構(gòu)建了ΔagrB/D/C/Newman敲除株,與野生株Newman相比,敲除株溶血能力顯著降低,色素形成能力顯著降低,生物膜形成能力顯著增加;敲除株培養(yǎng)上清中的蛋白種類和數(shù)量較野生株顯著減少;實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-PCR）結(jié)果顯示ΔagrB/D/C/Newman敲除株毒力因子的轉(zhuǎn)錄水平較野生株顯著降低.結(jié)論:agrB/D/C能夠影響AgrA的表達(dá)從而影響Agr系統(tǒng)的功能,agrB/D/C基因敲除后顯著改變毒力因子的表達(dá)水平. 

【文章來源】：暨南大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)與醫(yī)學(xué)版). 2019,40(06)北大核心CSCD

【文章頁數(shù)】：8 頁

【部分圖文】：

ΔagrB/D/C/Newman敲除株的PCR鑒定

對野生株以及敲除株的溶血活性、色素、生物膜形成能力等生物學(xué)特性進(jìn)行分析,結(jié)果表明,ΔagrB/D/C/Newman敲除株的溶血活性顯著低于野生株(圖2A);過夜培養(yǎng)Newman野生株與敲除株,與野生株Newman相比,ΔagrB/D/C/Newman敲除株色素形成能力減弱,形成灰白色的菌落(圖2B).用結(jié)晶紫染色法測定野生株與敲除株生物膜形成能力,結(jié)果顯示,ΔagrB/D/C/Newman敲除株的生物膜形成能力顯著高于野生株(圖2C).2.3 ΔagrB/D/C/Newman敲除株培養(yǎng)上清蛋白

37 ℃ 過夜培養(yǎng)金葡菌Newman野生株和ΔagrB/D/C/Newman敲除株次日按1∶100體積比轉(zhuǎn)種新鮮TSB培養(yǎng)基培養(yǎng)18 h,離心收集培養(yǎng)上清,TCA法沉淀上清蛋白,而后經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10% 的SDS-PAGE電泳,考馬斯亮藍(lán)染色.結(jié)果顯示:Δagr B/D/C/Newman敲除株與野生株培養(yǎng)上清的蛋白表達(dá)譜有顯著差異.與Newman野生株相比,agrB/D/C的敲除可導(dǎo)致多個分泌蛋白表達(dá)水平明顯降低(圖3),同時(shí)也會導(dǎo)致部分蛋白表達(dá)上升,這可能與 Agr 系統(tǒng)活性降低有關(guān).將野生株和Δagr B/D/C敲除株差異蛋白條帶進(jìn)行質(zhì)譜分析,結(jié)果顯示 ΔagrB/D/C敲除株上清蛋白與野生株蛋白差異最大的幾條主要條帶分別為α-溶血素(alpha-hemolysin,hla)相對分子量為41.00;γ-溶血素(gamma-hemolysin, hlgB)相對分子量為35.00;酚溶調(diào)蛋白(phenol-soluble modulin,psm)相對分子量為44.00; 絲氨酸氨酸蛋白酶(staphylococcal serine proteinase A,sspa)相對分子量為25.00等(表2),表明金葡菌的這些毒力因子的表達(dá)主要受 Agr 系統(tǒng)調(diào)控.2.4 qRT-PCR測定毒力因子轉(zhuǎn)錄水平

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]重慶西南醫(yī)院骨科感染金黃色葡萄球菌的分子分型及耐藥性研究[J]. 王軼男,鳳梓涵,徐磊,姜北,黎庶,傅景曙,謝肇,王海連,胡曉梅.  暨南大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)與醫(yī)學(xué)版). 2016(06)
[2]saeRS對金黃色葡萄球菌臨床分離株的hla和lukS-PV表達(dá)的影響[J]. 屠金晶,張協(xié),許園園,尚永朋,樓丹萍,武有聰,瞿滌,王良興,余方友.  中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志. 2013 (02)

碩士論文
[1]檸檬酸循環(huán)調(diào)節(jié)金黃色葡萄球菌金黃色素的產(chǎn)生[D]. 李晗.第二軍醫(yī)大學(xué) 2012



本文編號：3307941