表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor,EGFR）屬于酪氨酸激酶受體,它通過激活下游信號蛋白調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長、增殖。由于EGFR在多種惡性腫瘤組織中異常表達(dá)或突變,因此EGFR也是腫瘤治療的重要靶點(diǎn),但EGFR在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中的具體作用尚不完全清楚。此外,過氧化物酶體增殖物激活受體γ（peroxisome proliferator-activated receptorγ,PPARγ）是一類核激素受體,廣泛參與糖尿病、動脈粥樣硬化、炎癥、癌癥等病理生理過程并發(fā)揮重要作用。PPARγ能通過抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移及促進(jìn)凋亡等途徑發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)。我們之前的研究鑒定了PPARγ具有E3泛素連接酶的功能,前者通過與NFκB/p65相互作用,誘導(dǎo)p65蛋白泛素化、降解,從而終止NFκB介導(dǎo)的炎癥、腫瘤發(fā)生。然而,EGFR與PPARγ相互關(guān)系機(jī)制依然不清楚。此外,EGFR/PPARγ/NFκB信號軸如何發(fā)揮作用機(jī)制仍然不明。在本研究中,我們發(fā)現(xiàn)激活的EGFR發(fā)生細(xì)胞核轉(zhuǎn)位,從而磷酸化PPARγ-Y74位點(diǎn),并招募泛素化連接酶MDM2將PPARγ泛... 

【文章來源】：江蘇大學(xué)江蘇省

【文章頁數(shù)】：77 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第一章 緒論
    1.1 PPARγ
        1.1.1 PPARγ概述
        1.1.2 PPARγ及其配體與腫瘤
        1.1.3 PPARγ作為泛素化連接酶的生物學(xué)功能
    1.2 EGFR
        1.2.1 EGFR概述
        1.2.2 細(xì)胞核內(nèi)EGFR
        1.2.3 細(xì)胞核內(nèi)EGFR與腫瘤治療
    1.3 MDM2(murine double minute2)
        1.3.1 MDM2概述
        1.3.2 MDM2的生理功能
    1.4 本研究的意義
    1.5 主要研究內(nèi)容和技術(shù)路線
        1.5.1 主要研究內(nèi)容
        1.5.2 技術(shù)路線
第二章 EGFR誘導(dǎo)PPARγ-Y74磷酸化
    2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        2.1.1 細(xì)胞系
        2.1.2 實(shí)驗(yàn)動物
        2.1.3 實(shí)驗(yàn)試劑
        2.1.4 實(shí)驗(yàn)儀器和設(shè)備
    2.2 試驗(yàn)方法
        2.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)
        2.2.2 細(xì)胞總蛋白樣品的制備
        2.2.3 細(xì)胞總蛋白濃度測定
        2.2.4 細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核的分離
        2.2.5 Western Blot檢測
        2.2.6 抗體制備
        2.2.7 PPARγ原核表達(dá)載體的構(gòu)建
        2.2.8 PPARγ-Y74A原核表達(dá)載體的構(gòu)建：點(diǎn)突變
        2.2.9 GST-PPARγ和GST-PPARγ-Y74A蛋白的表達(dá)與純化
        2.2.10 磷酸化位點(diǎn)預(yù)測
        2.2.11 體外磷酸化
    2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析
        2.3.1 細(xì)胞核EGFR與PPARγ的相互關(guān)系
        2.3.2 軟件預(yù)測PPARγ可能的磷酸化位點(diǎn)
        2.3.3 體外磷酸化驗(yàn)證PPARγ磷酸化位點(diǎn)
        2.3.4 EGFR調(diào)節(jié)PPARγ-Y74磷酸化
    2.4 本章小結(jié)
第三章 PPARγ-Y74A突變體抑制EGFR/MDM2信號介導(dǎo)的PPARγ 降解
    3.1 實(shí)驗(yàn)材料
        3.1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞系
        3.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑
        3.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器與設(shè)備
    3.2.實(shí)驗(yàn)方法
        3.2.1 細(xì)胞轉(zhuǎn)染（以96孔板為例）
        3.2.2 免疫共沉淀Co-IP
        3.2.3 細(xì)胞內(nèi)PPARγ泛素化檢測
    3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        3.3.1 MDM2與PPARγ在細(xì)胞內(nèi)的相互關(guān)系
        3.3.2 PPARγ- Y74A突變體抑制了MDM2和PPARγ的綁定關(guān)系
        3.3.3 PPARγ-Y74A抑制了EGFR/MDM2信號介導(dǎo)的泛素化過程
        3.3.4 PPARγ-Y74A抑制了EGFR/MDM2信號介導(dǎo)的PPARγ的降解
    3.4 本章小結(jié)
第四章 PPARγ-Y74A突變體抑制EGFR/NFκB信號激活
    4.1 實(shí)驗(yàn)材料
        4.1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞系
        4.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑
        4.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器與設(shè)備
    4.2 實(shí)驗(yàn)方法
        4.2.1 mRNA的提取
        4.2.2 反轉(zhuǎn)錄PCR
        4.2.3 熒光定量PCR
    4.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        4.3.1 PPARγ與EGFR/NFκB信號的關(guān)系
        4.3.2 PPARγ-Y74A與EGFR/NFκB信號的關(guān)系
        4.3.3 PPARγ-Y74A與EGFR/NFκB介導(dǎo)基因表達(dá)
    4.4 本章小結(jié)
第五章 PPARγ-Y74A突變體抑制腫瘤細(xì)胞增生、增強(qiáng)化療藥物敏感性
    5.1 實(shí)驗(yàn)材料
        5.1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞
        5.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑
        5.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器
    5.2 實(shí)驗(yàn)方法
        5.2.1 穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系的構(gòu)建
        5.2.2 細(xì)胞計(jì)數(shù)
        5.2.3 軟瓊脂克隆集落形成實(shí)驗(yàn)soft agar colony formation assay
        5.2.4 MTT實(shí)驗(yàn)
        5.2.5 Annexin V/PI雙染色法測細(xì)胞凋亡
        5.2.6 免疫組化
    5.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        5.3.1 PPARγ-Y74A抑制了c-Myc等抗凋亡蛋白基因表達(dá)
        5.3.2 PPARγ-Y74A抑制了腫瘤細(xì)胞的增殖
        5.3.3 PPARγ-Y74A增加了細(xì)胞對化療藥物的敏感性
        5.3.4 PPARγ-Y74A增加化療藥物誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡
        5.3.5 PPARγ和p-PPARγ-Y74在腫瘤組織中的表達(dá)
    5.4 本章小結(jié)
第六章 總結(jié)
參考文獻(xiàn)
致謝
在學(xué)期間的學(xué)術(shù)成果
參加課題


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]Suppression of pancreatic carcinoma growth by activating peroxisome proliferator-activated receptor γ involves angiogenesis inhibition[J]. Yu-Wei Dong,Kai Wu,Department of Gastroenterology,Shanghai First People’s Hospital,Shanghai Jiaotong University,Shanghai 200080,China Xing-Peng Wang,Department of Gastroenterology,The Tenth People’s Hospital of Tongji University,Yanchang Road(M) ,Shanghai 200072,China.  World Journal of Gastroenterology. 2009(04)



本文編號：3287790