目的為構(gòu)建野生型和酶活缺失型人乙酰肝素酶（HPA）的慢病毒表達載體,以探討HPA的酶活性作用和非酶活性作用。方法根據(jù)GV358慢病毒質(zhì)粒載體序列和HPA基因序列設(shè)計用于無縫克隆的引物,HPA的PCR擴增產(chǎn)物與線性化的GV358質(zhì)粒載體連接,獲得重組慢病毒質(zhì)粒。將經(jīng)測序驗證的重組慢病毒質(zhì)粒與包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK-293T細胞,收取病毒感染液并感染HEL細胞,利用Western印跡法鑒定HPA過表達效果;利用流式細胞術(shù)檢測細胞表面硫酸乙酰肝素（HS）的表達量;利用ELISA檢測多配體蛋白聚糖1（syndecan-1）的釋放量,以驗證野生型和酶活缺失型HPA慢病毒表達載體的生物學(xué)效應(yīng)。結(jié)果重組慢病毒質(zhì)粒測序結(jié)果符合預(yù)期;Western印跡法檢測結(jié)果表明,過表達HPA的HEL細胞有明顯的HPA蛋白表達;流式細胞術(shù)結(jié)果顯示,過表達野生型HPA的HEL細胞表面HS表達量的幾何平均熒光強度（160.0±8.0）明顯低于空載體對照細胞（345.0±15.2）（P<0.01）;ELISA結(jié)果顯示,過表達野生型HPA的HEL細胞培養(yǎng)基中多配體蛋白聚糖1的釋放量（59.0±3.8）ng·L^-... 

【文章來源】：中國藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志. 2019,33(12)北大核心

【文章頁數(shù)】：7 頁

【文章目錄】：
1 材料與方法
    1.1 藥物、試劑和儀器
    1.2 細胞、質(zhì)粒和模板
    1.3 引物設(shè)計
    1.4 定點突變
    1.5 野生型和酶活缺失型HPSE慢病毒質(zhì)粒載體的構(gòu)建
    1.6 慢病毒包裝
    1.7 穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株構(gòu)建
    1.8 Western印跡法檢測HPA過表達效果
    1.9 過表達野生型/酶活缺失型HPA的HEL細胞中HPA酶活性的比較
        1.9.1 流式細胞術(shù)檢測細胞表面HS表達量的變化
        1.9.2 ELISA法檢測細胞培養(yǎng)基中多配體蛋白聚糖1的釋放量
    1.1 0 統(tǒng)計學(xué)分析
2 結(jié)果
    2.1 野生型和酶活缺失型的HPA慢病毒質(zhì)粒載體的驗證
    2.2 穩(wěn)定過表達野生型和酶活缺失型HPA的HEL細胞系的建立
    2.3 過表達野生型和酶活缺失型HPA的HEL細胞中HPA酶活性的比較
3 討論



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