目的為構(gòu)建野生型和酶活缺失型人乙酰肝素酶（HPA）的慢病毒表達(dá)載體,以探討HPA的酶活性作用和非酶活性作用。方法根據(jù)GV358慢病毒質(zhì)粒載體序列和HPA基因序列設(shè)計(jì)用于無(wú)縫克隆的引物,HPA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與線性化的GV358質(zhì)粒載體連接,獲得重組慢病毒質(zhì)粒。將經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證的重組慢病毒質(zhì)粒與包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK-293T細(xì)胞,收取病毒感染液并感染HEL細(xì)胞,利用Western印跡法鑒定HPA過(guò)表達(dá)效果;利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面硫酸乙酰肝素（HS）的表達(dá)量;利用ELISA檢測(cè)多配體蛋白聚糖1（syndecan-1）的釋放量,以驗(yàn)證野生型和酶活缺失型HPA慢病毒表達(dá)載體的生物學(xué)效應(yīng)。結(jié)果重組慢病毒質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果符合預(yù)期;Western印跡法檢測(cè)結(jié)果表明,過(guò)表達(dá)HPA的HEL細(xì)胞有明顯的HPA蛋白表達(dá);流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示,過(guò)表達(dá)野生型HPA的HEL細(xì)胞表面HS表達(dá)量的幾何平均熒光強(qiáng)度（160.0±8.0）明顯低于空載體對(duì)照細(xì)胞（345.0±15.2）（P<0.01）;ELISA結(jié)果顯示,過(guò)表達(dá)野生型HPA的HEL細(xì)胞培養(yǎng)基中多配體蛋白聚糖1的釋放量（59.0±3.8）ng·L^-... 

【文章來(lái)源】：中國(guó)藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志. 2019,33(12)北大核心

【文章頁(yè)數(shù)】：7 頁(yè)

【文章目錄】：
1 材料與方法
    1.1 藥物、試劑和儀器
    1.2 細(xì)胞、質(zhì)粒和模板
    1.3 引物設(shè)計(jì)
    1.4 定點(diǎn)突變
    1.5 野生型和酶活缺失型HPSE慢病毒質(zhì)粒載體的構(gòu)建
    1.6 慢病毒包裝
    1.7 穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株構(gòu)建
    1.8 Western印跡法檢測(cè)HPA過(guò)表達(dá)效果
    1.9 過(guò)表達(dá)野生型/酶活缺失型HPA的HEL細(xì)胞中HPA酶活性的比較
        1.9.1 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面HS表達(dá)量的變化
        1.9.2 ELISA法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)基中多配體蛋白聚糖1的釋放量
    1.1 0 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
2 結(jié)果
    2.1 野生型和酶活缺失型的HPA慢病毒質(zhì)粒載體的驗(yàn)證
    2.2 穩(wěn)定過(guò)表達(dá)野生型和酶活缺失型HPA的HEL細(xì)胞系的建立
    2.3 過(guò)表達(dá)野生型和酶活缺失型HPA的HEL細(xì)胞中HPA酶活性的比較
3 討論



本文編號(hào)：3281892