發(fā)布時(shí)間：2017-04-24 20:00

  本文關(guān)鍵詞：應(yīng)用酵母表面展示技術(shù)篩選可誘導(dǎo)HIV-1廣譜中和抗體的膜蛋白抗原的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：HIV-1疫苗是當(dāng)今人類面臨最難攻克的疫苗之一�，F(xiàn)有的疫苗抗原無(wú)法誘導(dǎo)出廣譜的中和抗體,成為目前有效疫苗設(shè)計(jì)的一個(gè)主要障礙。HIV-1完整膜蛋白、重組蛋白以及病毒樣顆粒,存在抗原表位暴露程度低、非特異表位競(jìng)爭(zhēng)、表位暴露存在時(shí)效性等缺點(diǎn),不能成為理想的疫苗候選抗原。HIV-1病毒的包膜蛋白gp41的MPER區(qū)是能夠引起多種廣泛中和抗體(2F5,4E10和10E8等)的重要靶點(diǎn),MPER區(qū)在病毒與細(xì)胞膜融合的過(guò)程中起到重要的作用,在gp120-CD4結(jié)合后,MPER區(qū)發(fā)生了一系列構(gòu)象的變化,中和抗原表位也發(fā)生了短暫的暴露,被機(jī)體免疫系統(tǒng)識(shí)別,從而產(chǎn)生廣譜中和抗體應(yīng)答。但是MPER區(qū)復(fù)雜且多變的構(gòu)象導(dǎo)致我們無(wú)法獲得其構(gòu)象的詳細(xì)信息,因此為了獲得強(qiáng)的針對(duì)MPER區(qū)的廣譜中和抗體反應(yīng),我們做了如下的設(shè)計(jì):一、利用隨機(jī)突變PCR技術(shù),構(gòu)建一個(gè)gp41-MPER突變文庫(kù),為使文庫(kù)產(chǎn)生足夠程度的突變,即讓蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生一定的改變但又不發(fā)生太大的變化,Error-Prone PCR設(shè)定條件時(shí)將采用0.2%~5%的突變率,然后將突變文庫(kù)構(gòu)建到釀酒酵母表達(dá)載體p CTCON2上,形成一個(gè)p CTCON2-MPER突變庫(kù)。二、利用酵母表面展示系統(tǒng),將突變文庫(kù)電轉(zhuǎn)導(dǎo)入酵母細(xì)胞,半乳糖誘導(dǎo)表達(dá),從而將突變蛋白庫(kù)展示到酵母表面。三、利用流式細(xì)胞篩選技術(shù),篩選出與廣譜中和抗體2F5、4E10結(jié)合力強(qiáng)的突變株,將篩選出的細(xì)胞重新放入培養(yǎng)基培養(yǎng),按上述步驟,進(jìn)行二次篩選,重復(fù)四次,經(jīng)四次篩選后,認(rèn)為所獲得的展示酵母應(yīng)與相對(duì)應(yīng)的抗體結(jié)合能力最強(qiáng)。四、對(duì)篩選出的抗原進(jìn)行序列分析確定目的抗原,提取基因組,測(cè)序,確定突變位置。五、分析篩選出的抗原誘導(dǎo)相應(yīng)中和抗體的能力,將展示抗原的酵母突變株免疫實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,三次免疫,免疫后取血清,利用間接ELISA檢測(cè)法,檢測(cè)突變抗原蛋白的免疫原性,即豚鼠血清中4E10、2F5樣抗體的滴度。本研究的意義:(1)本課題利用酵母展示技術(shù)篩選出與廣譜中和抗體具有高親和力的抗原。(2)對(duì)篩選出的抗原進(jìn)行序列分析可知哪些位點(diǎn)能夠影響抗原抗體的結(jié)合。(3)對(duì)篩選出的理想抗原可以進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析,分析所獲得的突變抗原在結(jié)構(gòu)及抗原位點(diǎn)上與原始抗原有何異同,從而希望獲得有利于疫苗抗原設(shè)計(jì)的大量數(shù)據(jù)信息,以指導(dǎo)其作為疫苗候選抗原表位。
【關(guān)鍵詞】：HIV-1 MPER 廣譜中和抗體 酵母表面展示 Error-Prone PCR 抗原篩選
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R392.11
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-11
• 第一章 前言11-22
• 1.1 艾滋病簡(jiǎn)介11-14
• 1.1.1 艾滋病的現(xiàn)狀11
• 1.1.2 HIV-1 病毒概況11-12
• 1.1.3 HIV-1 病毒生活周期以及致病機(jī)制12-13
• 1.1.4 HIV-1 在細(xì)胞內(nèi)的逃逸機(jī)制13-14
• 1.2 HIV-1 主要抗原表位14-16
• 1.2.1 gp12014
• 1.2.2 gp4114-16
• 1.3 HIV-1 疫苗研究進(jìn)展16-17
• 1.4 豚鼠動(dòng)物模型17
• 1.5 酵母表面展示技術(shù)17-19
• 1.6 流式細(xì)胞術(shù)的應(yīng)用及優(yōu)勢(shì)19
• 1.7 立題依據(jù)及設(shè)計(jì)19-22
• 第二章 重組質(zhì)粒構(gòu)建以及酵母細(xì)胞表達(dá)檢測(cè)22-39
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料22-28
• 2.1.1 儀器22
• 2.1.2 常用試劑22-23
• 2.1.3 載體與質(zhì)粒23
• 2.1.4 溶液配制23-28
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法28-33
• 2.2.1 序列設(shè)計(jì)28-29
• 2.2.2 PCR 合成目的片段29-30
• 2.2.3 重組p-EASY克隆載體的構(gòu)建30-31
• 2.2.4 重組pCTCON2載體的構(gòu)建31-32
• 2.2.5 質(zhì)粒電轉(zhuǎn)酵母細(xì)胞以及鑒定方法32
• 2.2.6 酵母細(xì)胞表達(dá)以及檢測(cè)方法32-33
• 2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果33-38
• 2.3.1 PCR擴(kuò)增目的片段結(jié)果33-34
• 2.3.2 重組p-EASY結(jié)果34-35
• 2.3.3 重組pCTCON2載體的構(gòu)建結(jié)果35-36
• 2.3.4 重組pCTCON2表達(dá)載體電轉(zhuǎn)酵母結(jié)果36
• 2.3.5 酵母細(xì)胞表達(dá)以及檢測(cè)結(jié)果36-38
• 2.4 本章小結(jié)38-39
• 第三章 利用易錯(cuò)PCR構(gòu)建插入序列的突變文庫(kù)39-43
• 3.1 實(shí)驗(yàn)材料39
• 3.1.1 儀器39
• 3.1.2 常用試劑39
• 3.1.3 載體與質(zhì)粒39
• 3.2 實(shí)驗(yàn)方法39-41
• 3.2.1 隨機(jī)突變引物設(shè)計(jì)39
• 3.2.2 利用隨機(jī)突變?cè)噭┖薪ń湍竿蛔兾膸?kù)39-41
• 3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果41-42
• 3.3.1 利用隨機(jī)突變建酵母突變文庫(kù)結(jié)果41-42
• 3.4 本章小結(jié)42-43
• 第四章 用FACS分析分選與中和廣譜抗體結(jié)合力強(qiáng)的抗原43-49
• 4.1 實(shí)驗(yàn)材料43
• 4.1.1 儀器43
• 4.1.2 常用試劑43
• 4.1.3 溶液配制43
• 4.2 實(shí)驗(yàn)方法43-45
• 4.2.1 將突變庫(kù)質(zhì)粒電轉(zhuǎn)導(dǎo)入酵母細(xì)胞43-44
• 4.2.2 流式分選與中和廣譜抗體結(jié)合力強(qiáng)的抗原44-45
• 4.2.3 分析篩選出的抗原與原始抗原位點(diǎn)上的異同45
• 4.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果45-48
• 4.3.1 流式細(xì)胞儀分選與 2F5/4E10抗體結(jié)合力高的酵母細(xì)胞群45-46
• 4.3.2 篩選與抗體 2F5/4E10的結(jié)合力強(qiáng)的單個(gè)酵母細(xì)胞46-47
• 4.3.3 分析篩選出的抗原與原始抗原位點(diǎn)上的異同47-48
• 4.4 本章小結(jié)48-49
• 第五章 對(duì)篩選出的抗原免疫原性的表征49-54
• 5.1 實(shí)驗(yàn)材料49-50
• 5.1.1 主要試劑49-50
• 5.1.2 多肽50
• 5.1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物50
• 5.2 實(shí)驗(yàn)方法50-51
• 5.2.1 驗(yàn)證多肽免疫原表位正確性50
• 5.2.2 免疫動(dòng)物策略50-51
• 5.2.3 動(dòng)物采血51
• 5.2.4 ELISA檢測(cè)51
• 5.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果51-53
• 5.3.1 驗(yàn)證多肽免疫原表位正確性結(jié)果51-52
• 5.3.2 ELISA檢測(cè)免疫原免疫豚鼠血清中特異性IgG的水平52-53
• 5.4 本章小結(jié)53-54
• 第六章 結(jié)論54-56
• 6.1 討論54
• 6.2 結(jié)論54-55
• 6.3 創(chuàng)新點(diǎn)與展望55-56
• 參考文獻(xiàn)56-59
• 致謝59

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 胡新韜;洪坤學(xué);邵一鳴;;抗HIV廣譜中和血清表位特異性研究進(jìn)展[J];中國(guó)熱帶醫(yī)學(xué);2011年05期

  本文關(guān)鍵詞：應(yīng)用酵母表面展示技術(shù)篩選可誘導(dǎo)HIV-1廣譜中和抗體的膜蛋白抗原的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號(hào)：324833