目的構(gòu)建人可溶性生長刺激表達(dá)基因2（sST2）蛋白的重組真核表達(dá)載體,獲得高純度的人sST2重組蛋白。方法根據(jù)人sST2基因序列設(shè)計引物,利用RT-PCR技術(shù)獲得人sST2基因;構(gòu)建人sST2-pcDNA3.1-his（-）重組真核表達(dá)載體;脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染COS7細(xì)胞,表達(dá)人sST2重組蛋白,并用鎳柱親和層析法純化;用western blot和ELISA法對人sST2重組蛋白進(jìn)行鑒定。結(jié)果 PCR擴增產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳分析,結(jié)果顯示產(chǎn)物長度與預(yù)期一致,約為1 000 bp;同源性比對分析結(jié)果顯示,人sST2基因成功插入PGH-T載體;用BamHⅠ和HindⅢ對重組真核表達(dá)載體雙酶切后凝膠電泳分析,結(jié)果顯示產(chǎn)物電泳位置與預(yù)期一致;表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示在相對分子質(zhì)量（Mr）約為65 000處有一明顯條帶,與預(yù)期蛋白質(zhì)位置一致;western blot鑒定結(jié)果顯示人sST2重組蛋白有His標(biāo)簽,ELISA鑒定結(jié)果顯示人sST2重組蛋白有與抗sST2抗體結(jié)合的特異性抗原表位。結(jié)論通過重組DNA技術(shù)成功構(gòu)建人sST2基因重組真核表達(dá)載體,通過蛋白質(zhì)純化技術(shù)成功獲得人sST2重組... 

【文章來源】：臨床檢驗雜志. 2020,38(02)

【文章頁數(shù)】：5 頁

【部分圖文】：

人sST2基因PCR擴增產(chǎn)物凝膠電泳分析

人sST2-PGH-T重組載體轉(zhuǎn)化大腸埃希菌DH5α感受態(tài)后,經(jīng)菌落PCR鑒定,瓊脂糖凝膠電泳出現(xiàn)陽性條帶。同源比對分析結(jié)果顯示人sST2成功插入T載體(只出現(xiàn)1個堿基突變)(見圖2)。2.3 人sST2-pcDNA3.1-his(-)重組真核表達(dá)載體鑒定

用BamHⅠ和HindⅢ雙酶切人sST2-PGH-T重組載體和pcDNA3.1-his(-)質(zhì)粒后瓊脂糖凝膠電泳顯示產(chǎn)物電泳位置與預(yù)期一致(見圖3),目的片段膠回收后T4酶連接獲得人sST2-pcDNA3.1-his(-)重組真核表達(dá)載體并再次BamHⅠ和HindⅢ雙酶切鑒定。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示產(chǎn)物電泳位置與預(yù)期一致(見圖4)。圖4 人sST2-pcDNA3.1-his(-)重組表達(dá)載體雙酶切產(chǎn)物鑒定

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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本文編號：3246783