丙型肝炎病毒（Hepatitis C Virus, HCV）是黃病毒家族的肝炎病毒屬,是具有包膜糖蛋白的單股正鏈RNA病毒,感染人肝臟后主要引起慢性感染。全球約有1.7億人口感染HCV,70%的急性感染患者進(jìn)展為慢性感染,并常進(jìn)一步發(fā)展為肝纖維化和肝癌。HCV共有6-7個基因型,其中基因型1,2,3在世界范圍內(nèi)流行,基因型4主要在埃及,基因型5主要在南非,基因型6主要在東南亞,我國流行的HCV主要是1b型和2型。HCV的傳播主要通過非腸道途徑,據(jù)WHO統(tǒng)計,僅通過不安全的注射途徑導(dǎo)致的HCV新增感染每年約有2百萬人。迄今為止,HCV尚無有效的疫苗,其治療主要是聚乙二醇化干擾素聯(lián)合利巴韋林的給藥方案。該治療方法價格昂貴,其治療效果與HCV的基因型有一定相關(guān)性,并有一定副作用。因此研發(fā)新型的HCV疫苗對于HCV的治療及預(yù)防十分迫切和必要。E1和E2包膜糖蛋白對于HCV的進(jìn)入和感染有重要作用,其存在的豐富N-糖鏈能調(diào)節(jié)抗原性和免疫原性。本研究內(nèi)容主要是通過采用PCR的方法擴(kuò)增HCV1a型E1E2的基因,用定點(diǎn)突變PCR手段將E1E2基因上特定的N-糖基化位點(diǎn)突變,同時在E1E2的N端和C端同... 

【文章來源】：武漢大學(xué)湖北省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

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【學(xué)位級別】：博士

【部分圖文】：

兔抗E2的多克隆抗體的效價檢測10^/mlE2原核蛋白包被ELISA板，免疫前與免疫后的兔E2抗血清按照1:51200到1:400

1E2 N-g!ycosylalion mutants.nts amino acid position,屯represents N-glycans. N-glycan was reith Asp (D) at A^-glycosylation sites (N-X-T/S).化突變體在HeLa細(xì)胞，HepG2細(xì)胞和293T細(xì)胞中均2-M質(zhì)粒用lipofetamine 2000分別轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞，進(jìn)行La細(xì)胞48小時后，將細(xì)胞用4%多聚甲醒固定后，用細(xì)胞中EIE2及其突變株的表達(dá)，PI染細(xì)胞核。結(jié)果1E2-M在HeLa細(xì)胞中均有表達(dá)，而在pVAX-1空載轉(zhuǎn)2的表達(dá)，如圖5A所示。ElE2-WT和CpG-ElE2-M4的質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)2野生型和突變體糖蛋白與ER的共定位情況，結(jié)果進(jìn)N430位糖基化缺失后，不影響糖蛋白的表達(dá)以及與內(nèi))。A"■( PI Merer Mil PI Mtrcr

圖6. Western Blot檢測各糖基化突變體在293T細(xì)胞中的表達(dá)將E1E2-WT以及EIE2-M糖基化突變體的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，48小時后收獲細(xì)胞，獲取細(xì)胞裂解液，取20 i^g的總蛋白進(jìn)行Western Blot檢測。Fig.6 Expression of E1E2 N-glycosylation mutants in 293T cells by Western Blot.EIE2-WT and ElE2-M plasmids were transfected into 293T cell. After 48 hours, the cells were


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