目的:基質(zhì)干細胞（Mesenchymal/stromal stem cells,MSCs）具有多向分化的潛能,既可以向成骨細胞分化,又可以向脂肪細胞分化,其分化過程受內(nèi)外環(huán)境多種因素的影響,且成骨和成脂的分化具有相互制約作用,以達到一個動態(tài)平衡態(tài)狀態(tài)。Sprouty（SPRY）是一類在全身組織廣泛表達的軟脂�；椎鞍准易�,具有相對保守的序列。研究發(fā)現(xiàn)部分SPRY蛋白可能與骨發(fā)育過程有關,本研究旨在探究SPRY4對成骨細胞和脂肪細胞分化的作用及其機制。方法:1.通過qRT-PCR技術檢測Spry4在野生型小鼠各組織中的表達分布情況;分離并培養(yǎng)C57BL/6J小鼠原代骨髓基質(zhì)干細胞（BMSCs）,通過qRT-PCR技術檢測其向成骨細胞和脂肪細胞分化過程中Spry4的表達變化;2.在骨髓基質(zhì)細胞系ST2和MSCs中分別過表達Spry4后誘導其向成骨細胞和脂肪細胞分化,比較分化水平的差異。3.在ST2和MSCs中分別敲減Spry4后誘導其向成骨細胞和脂肪細胞分化,比較分化水平的差異。4.在ST2細胞中過表達和敲減Spry4后,通過免疫熒光及Western blotting技術檢測SPRY4對W... 

【文章來源】：天津醫(yī)科大學天津市 211工程院校

【文章頁數(shù)】：90 頁

【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

過表達Spry4對ST2細胞成脂分化的影響

天津醫(yī)科大學碩士學位論文 二、Sprouty-4 調(diào)控基質(zhì)干細胞分化機制的研究2.2.2 SPRY4 調(diào)控基質(zhì)干細胞向成骨細胞定向分化的機制研究2.2.2.1 ERK1/2-Wnt 通路參與 SPRY4 對基質(zhì)干細胞定向分化的調(diào)控2.2.2.1.1 過表達及敲減 Spry4 后，免疫熒光檢測 β-catenin 入核變化接種 ST2 細胞到 48 孔板內(nèi)，當細胞匯合度達到 30%左右時進行轉(zhuǎn)染，分別轉(zhuǎn)染 pcDNA3.1-Spry4 進行過表達 Spry4，以及轉(zhuǎn)染 Spry4 siRNA 降低內(nèi)源性Spry4 的表達水平。轉(zhuǎn)染后 48 h 孵育 β-catenin 一抗以及熒光標記的二抗，最后用 DAPI 染細胞核。熒光倒置顯微鏡下觀察并拍取照片，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-Spry4 的實驗組與對照組相比，β-catenin 入核減少（圖 2.2），說明SPRY4 對 Wnt 信號通路有抑制作用；相反，轉(zhuǎn)染 Spry4 siRNA 后，β-catenin 入核明顯增多（圖 2.2），說明 Spry4 siRNA 能夠激活 Wnt 信號通路，從而進一步說明了 SPRY4 對 Wnt 信號通路起抑制作用。Vector Spry4 Control siRNA Spry4 siRNA

天津醫(yī)科大學碩士學位論文 二、Sprouty-4 調(diào)控基質(zhì)干細胞分化機制的研究被抑制。相反降低內(nèi)源性 Spry4 的表達之后，t-β-catenin 及 non-p-β-catenin 蛋白水平則明顯升高，表明敲減 Spry4 之后 Wnt 信號通路被激活（圖 2.3 A）。之后為了進一步說明問題，我們用核蛋白提取試劑盒提取了核蛋白，通過 Westernblotting 技術檢測了核內(nèi) β-catenin 和 TCF7L2 的水平。實驗結(jié)果顯示，過表達 Spry4使得核內(nèi) β-catenin 和 TCF7L2 的水平下調(diào)（圖 2.3 B）。相反，降低內(nèi)源性 Spry4的表達，則使得核內(nèi) β-catenin 和 TCF7L2 的水平上調(diào)（圖 2.3 B）。以上對于t-β-catenin、non-p-β-catenin、β-catenin 和 TCF7L2 的檢測結(jié)果證明 SPRY4 對 Wnt信號通路有抑制作用。AB


本文編號：3130865