目的克隆幽門螺桿菌（Helicobacter pylori,Hp）D-丙氨酸-D-丙氨酸連接酶A（D-alanine-D-alanine ligase A, DdlA）基因ddlA編碼區(qū),并對(duì)其進(jìn)行測(cè)序和生物信息學(xué)分析。方法以MEL-Hp27菌株基因組DNA為模版,PCR擴(kuò)增ddlA基因編碼區(qū);將ddlA基因與真核表達(dá)載體pcDNA3.1（+）連接,構(gòu)建重組表達(dá)載體;測(cè)序獲得ddlA基因序列,利用生物信息學(xué)軟件對(duì)編碼DdlA蛋白的理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)特點(diǎn)進(jìn)行分析。結(jié)果 MEL-Hp27 ddlA基因的編碼區(qū)長(zhǎng)為1 044 bp,編碼347個(gè)氨基酸;編碼的DdlA蛋白是一種性質(zhì)穩(wěn)定的親水蛋白,相對(duì)分子質(zhì)量為39.61×10³,屬于D-ala-D-ala連接酶N端家族;DdlA蛋白無跨膜區(qū)和信號(hào)肽,具有磷酸化位點(diǎn)和O-糖基化位點(diǎn);二級(jí)結(jié)構(gòu)中α-螺旋占36.02%,無規(guī)卷曲Cc占42.36%,延伸鏈Ee占18.73%,β-轉(zhuǎn)角Tt占2.88%。DdlA蛋白含有7個(gè)B淋巴細(xì)胞和15個(gè)CTL細(xì)胞相關(guān)抗原表位。結(jié)論成功克隆了Hp27 ddlA基因,構(gòu)建了該基因的真核表達(dá)載體,表達(dá)的... 

【文章來源】：中國(guó)病原生物學(xué)雜志. 2019,14(10)北大核心CSCD

【文章頁數(shù)】：7 頁

【部分圖文】：

圖１ＭＥＬ－Ｈｐ２７ｄｄｌＡ基因ＰＣＲ產(chǎn)物電泳分析

ｕｃｔｓＦｉｇ．１ＴｈｅｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓａｎａｌｙｓｉｓｏｆＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔｏｆＭＥＬ－Ｈｐ２７ｄｄｌＡ２重組質(zhì)粒的鑒定用限制性內(nèi)切酶ＥｃｏＲＩ和ＸｈｏＩ對(duì)重組質(zhì)粒ｐｃＤ－ＮＡ３．１（＋）－ｄｄｌＡ進(jìn)行酶切，經(jīng)１．０％瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳鑒定，得到約５０００ｂｐ和１０００ｂｐ２條片段，與預(yù)期片段大小相符，ｄｄｌＡ基因成功插入表達(dá)載體ｐｃＤ－ＮＡ３．１（＋）。測(cè)序顯示目的基因ｄｄｌＡ長(zhǎng)度為１０４４ｂｐ，與預(yù)期大小相符（圖２）。利用ＮＣＢＩＢＬＡＳＴ程序，將克隆的ｄｄｌＡ基因與ＧｅｎＢａｎｋ收錄的ＨｐｄｄｌＡ基因序列進(jìn)行比對(duì)分析，克隆基因ｄｄｌＡ與ＨＰＦ７２、ＨＰＦ２０９、ＨＰＭＫＭ５、ＨＰＡＧ１、Ｈｐ２６６９５菌株的ｄｄｌＡ基因同源性分別為９８．２８％、９８．０８％、９７．８０％、９５．１１％和９４．９２％。１ＤＮＡ標(biāo)志物（ＤＬ８０００）２ｐｃＤＮＡ３．１（＋）－ｄｄｌＡ雙酶切３ｐｃＤＮＡ３．１（＋）－ｄｄｌＡ單酶切４ｐｃＤＮＡ３．１（＋）－ｄｄｌＡ圖２重組質(zhì)粒ｐｃＤＮＡ３．１（＋）－ｄｄｌＡ酶切鑒定１ＤＮＡｍａｒｋｅｒ（ＤＬ８０００）２ｐｃＤＮＡ３．１（＋）－ｄｄｌＡｄｏｕｂｌｅｅｎ－ｚｙｍｅｄｉｇｅｓｔｉｏｎ３ｐｃＤＮＡ３．１（＋）－ｄｄｌＡａｓｉｎｇｌｅｅｎｚｙｍｅｄｉｇｅｓｔｉｏｎ４ｐｃＤＮＡ３．１（＋）－ｄｄｌＡＦｉｇ．２ＴｈｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｌａｓｍｉｄｐｃＤＮＡ３．１（＋）－ｄｄｌＡｅｎｚｙｍｅｄｉｇｅｓｔｉｏｎｉｄｅｎｔｉｆｉ

Ｌｅｕ）占比較高為１３．５％，賴氨酸（Ｌｙｓ）占１０．７％，其余氨基酸占比均＜１０％。ＤｄｌＡ蛋白帶正電荷（Ａｒｇ＋Ｌｙｓ）和負(fù)電荷（Ａｓｐ＋Ｇｌｕ）的殘基總數(shù)均為４４。ＤｄｌＡ蛋白不穩(wěn)定指數(shù)為３５．６２，為穩(wěn)定蛋白（不穩(wěn)定系數(shù)＜４０時(shí)定義為穩(wěn)定蛋白），脂肪族指數(shù)為１０２．８８。該蛋白的半衰期在體外哺乳動(dòng)物網(wǎng)狀細(xì)胞中為１００ｈ，在大腸埃希菌體內(nèi)＞１０ｈ，在酵母菌體內(nèi)＞２０ｈ。該蛋白平均親水指數(shù)為－０．１４０，屬于親水性蛋白（圖３）。圖３ＤｄｌＡ蛋白親疏水性分析Ｆｉｇ．３ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｏｆＤｄｌＡｐｒｏｔｅｉｎｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃｉｔｙａｎｄｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃｉｔｙａｎａｌｙｓｉｓ３．２ＤｄｌＡ蛋白信號(hào)肽和跨膜區(qū)分析采用ＳｉｇｎａｌＰ４．０ｓｅｒｖｅｒ和ＴＭＨＭＭＳｅｒｖｅｒ２．０預(yù)測(cè)分析ＤｄｌＡ蛋白無信號(hào)肽區(qū)域（圖４）和跨膜結(jié)構(gòu)（圖５），屬于胞內(nèi)蛋白。３．３ＤｄｌＡ蛋白的磷酸化位點(diǎn)當(dāng)閾值�。埃禃r(shí)，預(yù)測(cè)ＤｄｌＡ蛋白有２３個(gè)潛在的磷酸化位點(diǎn)，其中包括１４·１２１１·中國(guó)病原生物學(xué)雜志ＪｏｕｒｎａｌｏｆＰａｔｈｏｇｅｎＢｉｏｌｏｇｙ２０１９年１０月第１４卷第１０期Ｏｃｔ．２０１９，Ｖｏｌ．１４，Ｎｏ．１０

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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本文編號(hào)：3110136