目的克隆幽門螺桿菌（Helicobacter pylori,Hp）D-丙氨酸-D-丙氨酸連接酶A（D-alanine-D-alanine ligase A, DdlA）基因ddlA編碼區(qū),并對其進行測序和生物信息學(xué)分析。方法以MEL-Hp27菌株基因組DNA為模版,PCR擴增ddlA基因編碼區(qū);將ddlA基因與真核表達載體pcDNA3.1（+）連接,構(gòu)建重組表達載體;測序獲得ddlA基因序列,利用生物信息學(xué)軟件對編碼DdlA蛋白的理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)特點進行分析。結(jié)果 MEL-Hp27 ddlA基因的編碼區(qū)長為1 044 bp,編碼347個氨基酸;編碼的DdlA蛋白是一種性質(zhì)穩(wěn)定的親水蛋白,相對分子質(zhì)量為39.61×10³,屬于D-ala-D-ala連接酶N端家族;DdlA蛋白無跨膜區(qū)和信號肽,具有磷酸化位點和O-糖基化位點;二級結(jié)構(gòu)中α-螺旋占36.02%,無規(guī)卷曲Cc占42.36%,延伸鏈Ee占18.73%,β-轉(zhuǎn)角Tt占2.88%。DdlA蛋白含有7個B淋巴細胞和15個CTL細胞相關(guān)抗原表位。結(jié)論成功克隆了Hp27 ddlA基因,構(gòu)建了該基因的真核表達載體,表達的... 

【文章來源】：中國病原生物學(xué)雜志. 2019,14(10)北大核心CSCD

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【部分圖文】：

圖１ＭＥＬ－Ｈｐ２７ｄｄｌＡ基因ＰＣＲ產(chǎn)物電泳分析

ｕｃｔｓＦｉｇ．１ＴｈｅｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓａｎａｌｙｓｉｓｏｆＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔｏｆＭＥＬ－Ｈｐ２７ｄｄｌＡ２重組質(zhì)粒的鑒定用限制性內(nèi)切酶ＥｃｏＲＩ和ＸｈｏＩ對重組質(zhì)粒ｐｃＤ－ＮＡ３．１（＋）－ｄｄｌＡ進行酶切，經(jīng)１．０％瓊脂糖凝膠進行電泳鑒定，得到約５０００ｂｐ和１０００ｂｐ２條片段，與預(yù)期片段大小相符，ｄｄｌＡ基因成功插入表達載體ｐｃＤ－ＮＡ３．１（＋）。測序顯示目的基因ｄｄｌＡ長度為１０４４ｂｐ，與預(yù)期大小相符（圖２）。利用ＮＣＢＩＢＬＡＳＴ程序，將克隆的ｄｄｌＡ基因與ＧｅｎＢａｎｋ收錄的ＨｐｄｄｌＡ基因序列進行比對分析，克隆基因ｄｄｌＡ與ＨＰＦ７２、ＨＰＦ２０９、ＨＰＭＫＭ５、ＨＰＡＧ１、Ｈｐ２６６９５菌株的ｄｄｌＡ基因同源性分別為９８．２８％、９８．０８％、９７．８０％、９５．１１％和９４．９２％。１ＤＮＡ標志物（ＤＬ８０００）２ｐｃＤＮＡ３．１（＋）－ｄｄｌＡ雙酶切３ｐｃＤＮＡ３．１（＋）－ｄｄｌＡ單酶切４ｐｃＤＮＡ３．１（＋）－ｄｄｌＡ圖２重組質(zhì)粒ｐｃＤＮＡ３．１（＋）－ｄｄｌＡ酶切鑒定１ＤＮＡｍａｒｋｅｒ（ＤＬ８０００）２ｐｃＤＮＡ３．１（＋）－ｄｄｌＡｄｏｕｂｌｅｅｎ－ｚｙｍｅｄｉｇｅｓｔｉｏｎ３ｐｃＤＮＡ３．１（＋）－ｄｄｌＡａｓｉｎｇｌｅｅｎｚｙｍｅｄｉｇｅｓｔｉｏｎ４ｐｃＤＮＡ３．１（＋）－ｄｄｌＡＦｉｇ．２ＴｈｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｌａｓｍｉｄｐｃＤＮＡ３．１（＋）－ｄｄｌＡｅｎｚｙｍｅｄｉｇｅｓｔｉｏｎｉｄｅｎｔｉｆｉ

Ｌｅｕ）占比較高為１３．５％，賴氨酸（Ｌｙｓ）占１０．７％，其余氨基酸占比均＜１０％。ＤｄｌＡ蛋白帶正電荷（Ａｒｇ＋Ｌｙｓ）和負電荷（Ａｓｐ＋Ｇｌｕ）的殘基總數(shù)均為４４。ＤｄｌＡ蛋白不穩(wěn)定指數(shù)為３５．６２，為穩(wěn)定蛋白（不穩(wěn)定系數(shù)＜４０時定義為穩(wěn)定蛋白），脂肪族指數(shù)為１０２．８８。該蛋白的半衰期在體外哺乳動物網(wǎng)狀細胞中為１００ｈ，在大腸埃希菌體內(nèi)＞１０ｈ，在酵母菌體內(nèi)＞２０ｈ。該蛋白平均親水指數(shù)為－０．１４０，屬于親水性蛋白（圖３）。圖３ＤｄｌＡ蛋白親疏水性分析Ｆｉｇ．３ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｏｆＤｄｌＡｐｒｏｔｅｉｎｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃｉｔｙａｎｄｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃｉｔｙａｎａｌｙｓｉｓ３．２ＤｄｌＡ蛋白信號肽和跨膜區(qū)分析采用ＳｉｇｎａｌＰ４．０ｓｅｒｖｅｒ和ＴＭＨＭＭＳｅｒｖｅｒ２．０預(yù)測分析ＤｄｌＡ蛋白無信號肽區(qū)域（圖４）和跨膜結(jié)構(gòu)（圖５），屬于胞內(nèi)蛋白。３．３ＤｄｌＡ蛋白的磷酸化位點當閾值�。埃禃r，預(yù)測ＤｄｌＡ蛋白有２３個潛在的磷酸化位點，其中包括１４·１２１１·中國病原生物學(xué)雜志ＪｏｕｒｎａｌｏｆＰａｔｈｏｇｅｎＢｉｏｌｏｇｙ２０１９年１０月第１４卷第１０期Ｏｃｔ．２０１９，Ｖｏｌ．１４，Ｎｏ．１０

【參考文獻】：
期刊論文
[1]幽門螺桿菌金屬蛋白酶基因生物信息學(xué)分析[J]. 余飛艷,張惠娟,張榮光,王琛,王海燕,何夢雅,范清堂,段廣才.  中國病原生物學(xué)雜志. 2019(01)
[2]一株腸炎沙門氏菌鞭毛基因FliC的克隆及生物信息學(xué)分析[J]. 程相朝,田文靜,張夢珂,毛福超,廖成水.  中國畜牧獸醫(yī). 2018(12)
[3]結(jié)核分枝桿菌eis基因及其編碼蛋白的生物信息學(xué)分析[J]. 張西燕,付玉榮,伊正君.  中國病原生物學(xué)雜志. 2018(02)
[4]Role of Helicobacter pylori infection in pathogenesis of gastric carcinoma[J]. Rong-Guang Zhang,Guang-Cai Duan,Qing-Tang Fan,Shuai-Yin Chen.  World Journal of Gastrointestinal Pathophysiology. 2016(01)



本文編號：3110136