近年來，手足口�。╤and, foot and mouth disease, HFMD）在我國呈高發(fā)態(tài)勢，腸道病毒71型（enterovirus71, EV71）是其主要病原體之一，尤其重癥HFMD患者大多由EV71感染所致[1]。深入研究EV71的毒力和致病機(jī)理，對于HFMD的防治有著極其重要意義[2，3]。我們從HFMD重癥患者咽拭子標(biāo)本中分離EV71毒株，通過基因序列分析、病毒拯救等研究，分析比較分離病毒的毒力和免疫原性，為今后EV71動(dòng)物模型的構(gòu)建、EV71致病機(jī)理和疫苗的研究打下了基礎(chǔ)。本研究從2名臨床確診HFMD并出現(xiàn)嚴(yán)重神經(jīng)系統(tǒng)癥狀患兒的咽拭子標(biāo)本中分離到2株病毒，經(jīng)核酸分析和美國ATCC腸道病毒標(biāo)準(zhǔn)血清中和實(shí)驗(yàn)，確定為EV71。通過空斑實(shí)驗(yàn)，克隆得到兩株EV71病毒，分別命名為EV71-961和EV71-102。經(jīng)腸道病毒VP1區(qū)通用引物擴(kuò)增后，序列分析初步確定兩株分離病毒均為EV71C4亞型。病毒全基因序列分析顯示：兩株病毒基因組全長（不含polyA尾）均為7407nt；EV71-961全基因序列與Chongqing3-09-China（Genbank Number:... 

【文章來源】：中國人民解放軍醫(yī)學(xué)院北京市

【文章頁數(shù)】：104 頁

【學(xué)位級(jí)別】：博士

【部分圖文】：

EV71病毒基因組示意圖

、實(shí)驗(yàn)材料、 細(xì)胞和 EV71 標(biāo)本.1 細(xì)胞：Vero 細(xì)胞由本室保存。.2 EV71 標(biāo)本：2008 年湖南一名 3 歲和 2009 年湖南一名 1 歲均出現(xiàn)嚴(yán)重的手足口病患兒咽拭子標(biāo)本。、 載體、引物及感受態(tài)菌.1 載體.1.1 平端克隆載體：克隆載體質(zhì)粒pEASYTM-Blunt Zero Vector（圖1.2），載體,專為連接PCR高保真Taq酶（pfu酶）擴(kuò)增的產(chǎn)物片段而設(shè)計(jì)。該載殺基因表達(dá)與否篩選陽性重組子。當(dāng)載體與目的片段連接成功，載體自帶無法正確表達(dá)，包含重組子的細(xì)胞可以正常生長；當(dāng)載體與目的片段連殺基因可以正確表達(dá)，包含載體的細(xì)胞則無法生長，即“Zero”背景。該長片段克隆，且含氨芐青霉素、卡那霉素兩種篩選標(biāo)記。

圖1.3 克隆載體 pEASY-T3 圖譜2.2 引物合成：參照分離株VP1測序結(jié)果，經(jīng)Genbank序列比對確定為EV71 C4亞型，依據(jù)Genbank中C4序列保守區(qū)，使用Lasergene軟件設(shè)計(jì)4條全基因擴(kuò)增引物、4條EV71特異性鑒定引物、2條EV71 VP1區(qū)通用引物、1條逆轉(zhuǎn)錄引物（表1.1）。引物由Invitrogen公司合成。引物1F 5’端引入限制性酶切位點(diǎn)和T7RNA聚合酶啟動(dòng)子序列，1R的5’端引入限制性酶切位點(diǎn)，2R 5’端引入限制性酶切位點(diǎn)和26個(gè)堿基T（表1.1）。表1.1 病毒分離株全基因擴(kuò)增引物擴(kuò)增片段名稱及位置 名稱 序列 酶切位點(diǎn)A段1-3778 1F5’-AGGCGGATCGAT TAATACGACTCACTATAGTAAAACACCCTGTGGGTTGCACC-3’ClaⅠ1R 5’-GCGGCCGCACCACAAGAGGTCCCTGACGTCT-3’ NotⅠB段 3342-7424 2F 5’-AGTCTGGGGCCATTTATGTGGGCAACTTTA-3’2R5’-GCGGCCGC TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCTTTGCTATTCTGGTTATAAC-3’NotⅠ逆轉(zhuǎn)錄引物 oligdT26 5’-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3’鑒定引物732-1474 JD1F 5’-CAGCTAAACATGGGTTCG-3’JD1R 5’-ATACCAGCATCAAGCACG-3’鑒定引物5008-5735 JD2F 5’-GGGAATACAGCAATAGGTCCG-3’JD2R 5’-TGATGGCATGTGCTCTGTG-3’通用引物2367-2386 VP1-F3 5’-GCAGCCCAAAAGAATTTCAC-3’通用引物3346-3365 VP1-R3 5’-CACATAAATRGCCCCAGACT-3’注：序列下劃線為 T7RNA 聚合酶啟動(dòng)子序列，斜體為酶切位點(diǎn)序?

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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