目的:利用昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)早期快速反應(yīng)基因5（IER5）蛋白,為后續(xù)蛋白質(zhì)結(jié)晶及探索蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)提供線索。方法:以HeLa細(xì)胞cDNA為模板擴增出IER5基因片段,構(gòu)建重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pFastBac1-IER5;重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒經(jīng)雙酶切及測序鑒定后轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞DH10Bac,以獲得重組的穿梭質(zhì)粒rBacmid-IER5;將重組穿梭質(zhì)粒感染Sf9細(xì)胞,待細(xì)胞出現(xiàn)明顯病變時收集重組桿狀病毒;用間接免疫熒光、SDS-PAGE及Western blot以及對表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行分析鑒定。結(jié)果:重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pFastBac1-IER5經(jīng)雙酶切后得到與預(yù)期相同的2條條帶;重組穿梭質(zhì)粒rBacmid-IER5經(jīng)PCR鑒定在3 300 bp左右出現(xiàn)一條特異性條帶;間接免疫熒光結(jié)果提示IER5蛋白在Sf9細(xì)胞中得到表達(dá);SDS-PAGE結(jié)果顯示,表達(dá)產(chǎn)物的相對分子質(zhì)量約為48 k,Western blot結(jié)果表明表達(dá)產(chǎn)物能與IER5抗體特異性結(jié)合。結(jié)論:利用昆蟲-桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)成功表達(dá)了人IER5蛋白,獲得了體外表達(dá)重組IER5蛋白的相對分子質(zhì)量、溶解性等物理化學(xué)特性。 

【文章來源】：癌變·畸變·突變. 2020,32(01)

【文章頁數(shù)】：6 頁

【部分圖文】：

IER5基因擴增片段

將經(jīng)Eco RⅠ和HindⅢ酶切后的IER5片段和pFastBacTM1質(zhì)粒用T4DNA鏈接酶連接，轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞。擴大培養(yǎng)后提取重組質(zhì)粒，經(jīng)Eco RⅠ和HindⅢ酶酶切，再用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。電泳結(jié)果如圖2所示，在1 000 bp和4 700 bp處有2條與預(yù)期大小一樣的條帶，與預(yù)期條帶大小一致，表明IER5基因已經(jīng)成功克隆入pFastBacTM1質(zhì)粒中，成功構(gòu)建了重組桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體p FastBac1-IER5。2.3 PCR鑒定重組穿梭質(zhì)粒rBacmid-IER5

Sf9細(xì)胞感染重組桿狀病毒后，每隔12 h觀察一次細(xì)胞的形態(tài)。如圖4B所示，大約到72 h左右，感染重組病毒后的細(xì)胞開始出現(xiàn)明顯變化，細(xì)胞直徑慢慢增加，折光性變強，逐漸脫壁直至細(xì)胞破碎死亡。但圖4A所示的未感染重組病毒的細(xì)胞無明顯變化。2.5 重組IER5蛋白間接免疫熒光

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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