目的建立豬帶絳蟲(chóng)Ts14-3-3.3蛋白原核表達(dá)系統(tǒng)并制備兔多克隆抗體。方法通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）技術(shù)將豬囊尾蚴總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA,利用特異性引物擴(kuò)增豬帶絳蟲(chóng)Ts14-3-3.3基因,將其克隆至原核表達(dá)質(zhì)粒pCznⅠ中,在大腸桿菌Arctic Express中用異丙基硫代半乳糖苷（IPTG）誘導(dǎo)表達(dá),通過(guò)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分析其表達(dá)產(chǎn)物,用HisLink親和層析柱進(jìn)行純化,免疫印跡（Western blot）法鑒定純化后的Ts14-3-3.3重組蛋白。將純化的Ts14-3-3.3重組蛋白免疫新西蘭兔,制備Ts14-3-3.3多克隆抗體,Western blot和免疫組化法檢測(cè)Ts14-3-3.3天然蛋白在豬帶絳蟲(chóng)成蟲(chóng)和囊尾蚴的分布。結(jié)果成功構(gòu)建豬帶絳蟲(chóng)重組表達(dá)質(zhì)粒pCznⅠ-Ts14-3-3.3,經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá),獲得可溶性形式高效表達(dá)的Ts14-3-3.3重組蛋白,分子質(zhì)量約29.31 kD,純化后帶有His標(biāo)簽的Ts14-3-3.3重組蛋白能被抗血清所識(shí)別。用純化的Ts14-3-3.3重組蛋白免疫新西蘭兔,獲得了Ts14-3-3... 

【文章來(lái)源】：中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào). 2019,35(12)北大核心

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Ts14-3-3.3基因PCR擴(kuò)增

重組質(zhì)粒pCznI-Ts14-3-3.3經(jīng)NdeⅠ和XbaⅠ雙酶切鑒定后,得到4 400 bp的pCznI載體片段和747 bp的Ts14-3-3.3目的基因片段(見(jiàn)圖2)。測(cè)序結(jié)果表明重組質(zhì)粒pCznI-Ts14-3-3.3構(gòu)建成功。2.3 Ts14-3-3.3重組蛋白的表達(dá)、純化和鑒定

重組質(zhì)粒pCznⅠ-Ts14-3-3.3經(jīng)11 ℃、0.5 mmol/L IPTG誘導(dǎo)12 h后,SDS-PAGE分析,在分子質(zhì)量約29.31 kD處出現(xiàn)明顯條帶(見(jiàn)圖3),其分子質(zhì)量大小與預(yù)測(cè)分子量加上His標(biāo)簽分子量的大小相符,說(shuō)明該條帶為帶His標(biāo)簽的Ts14-3-3.3目的蛋白。Ts14-3-3.3重組蛋白主要以可溶形式存在于菌體處理后的上清液中。將Ts14-3-3.3重組蛋白通過(guò)HisLinkTM親和層析柱純化,獲得了大小約29.31 kD的單一目的蛋白條帶(見(jiàn)圖4)。用Anti-His標(biāo)簽抗體作為Western blot一抗,能夠識(shí)別表達(dá)的Ts14-3-3.3重組蛋白條帶(見(jiàn)圖5),說(shuō)明該蛋白攜帶有His標(biāo)簽,進(jìn)一步確認(rèn)該條帶為T(mén)s14-3-3.3目的蛋白條帶。圖4 Ts14-3-3.3重組蛋白的純化

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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