本文關(guān)鍵詞：Notch信號(hào)抑制劑和TLR配體聯(lián)合作為佐劑對(duì)呼吸道合胞病毒疫苗增強(qiáng)性免疫病理的調(diào)節(jié)作用，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:呼吸道合胞病毒(Respiratory syncytial virus,RSV)是一種副粘病毒科的單股負(fù)鏈RNA病毒,屬于肺炎病毒屬,是引起嬰幼兒下呼吸道感染最重要的病原體之一,嚴(yán)重危害了嬰幼兒的身體健康,在全球范圍內(nèi),每年大概約有數(shù)百萬兒童感染RSV病毒,其中50%以上為小于1歲的嬰兒,患兒可反復(fù)多次感染,嚴(yán)重者可以導(dǎo)致死亡;另外,RSV也是造成老年人群和免疫缺陷者高患病率和死亡率的重要原因。但是,目前尚無成功有效的疫苗,在二十世紀(jì)六十年代曾研制過福爾馬林滅活疫苗(FI-RSV),可惜接種幼兒后導(dǎo)致了嚴(yán)重的肺部疫苗增強(qiáng)性疾病,而且導(dǎo)致兩例死亡�，F(xiàn)在,世界衛(wèi)生組織已把呼吸道合胞病毒(RSV)疫苗確定為優(yōu)先發(fā)展的疫苗之一。Notch信號(hào)是一種信號(hào)傳導(dǎo)途徑,具高度保守性,其通過與相鄰細(xì)胞間的互相作用來調(diào)節(jié)各個(gè)組織和細(xì)胞的分化及發(fā)育,是一條重要的,影響細(xì)胞命運(yùn)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。它幾乎可以涉及調(diào)節(jié)所有細(xì)胞的分化、增殖和凋亡活動(dòng),因?yàn)槠湔{(diào)節(jié)細(xì)胞的分化、增殖和凋亡,所以對(duì)一系列生理和病理過程都有影響。在固有免疫以及適應(yīng)性免疫細(xì)胞的活化、增殖及分化過程中發(fā)揮著重要作用。在哺乳動(dòng)物中,Notch信號(hào)已鑒定出4個(gè)Notch受體(Notch1-4)和5個(gè)配體(Delta1、3、4及Jagged1、2)。Notch信號(hào)可能會(huì)通過影響疫苗刺激的APC及淋巴細(xì)胞的活性來調(diào)節(jié)RSV疫苗增強(qiáng)性肺部免疫病理。Cp G是TLR-9的配體,通過激活NF-κB而激活各種免疫細(xì)胞,具有廣泛的免疫調(diào)節(jié)作用,特別是Cp G促進(jìn)DCs產(chǎn)生IFN-γ等細(xì)胞因子,促進(jìn)Th1應(yīng)答,增強(qiáng)CTL活性等。所以,本研究以TLR-9的配體Cp G2216和Notch信號(hào)抑制劑作為疫苗FI-RSV的佐劑,通過抑制小鼠的Notch信號(hào),來研究Notch信號(hào)和Cp G在RSV疫苗增強(qiáng)性肺部免疫病理中的作用。方法：1培養(yǎng)Hep-2細(xì)胞,在Hep-2細(xì)胞上培養(yǎng)RSV,測(cè)定RSV滴度。2制備福爾馬林滅活疫苗(FI-RSV)、福爾馬林滅活加Al(OH)3疫苗(FI-RSV+Al(OH)3)和對(duì)照組疫苗(FI-control)。3動(dòng)物實(shí)驗(yàn)3.1小鼠免疫將54只6-9周齡雌性C57Bl/6小鼠隨機(jī)分為9組,每組6只,分別為①Control組,不作任何處理;②FI-control組;③FI-RSV組;⑤FI-RSV+Al(OH)3;④FI-RSV+Cp G組;⑥FI-control+DMSO組;⑦FI-RSV+L-685,458;⑧FI-RSV+Al(OH)3+L-685,458組;⑨FI-RSV+Cp G+L-685,458組,肌肉注射免疫,共免疫2次,每次間隔4周。3.2體液免疫檢測(cè)末次免疫后10天小鼠內(nèi)眥取血,分離血清,用空斑抑制實(shí)驗(yàn)檢測(cè)血清中和抗體水平,并用ELISA檢測(cè)特異性抗體Ig G、Ig G1和Ig G2a水平。3.3末次免疫4周后用100μl106pfu/ml的RSV攻擊被免疫小鼠(鼻腔),每天監(jiān)測(cè)被感染小鼠的體重,觀察是否有體重變化。3.4 5天后處死已攻毒的小鼠,提取組織并做相關(guān)檢測(cè)。3.5做肺組織病理切片,HE染色,觀察炎癥浸潤(rùn)情況;PAS(periodic acid Schiff)染色,觀察氣道粘液分泌情況;實(shí)時(shí)定量PCR測(cè)定肺組織中細(xì)胞因子和RSV-N基因的表達(dá)情況;支氣管肺泡灌洗液細(xì)胞涂片,觀察炎性細(xì)胞變化情況;檢測(cè)肺組織內(nèi)的病毒滴度,觀察疫苗的保護(hù)情況;ELISA檢測(cè)肺勻漿上清中細(xì)胞因子TNF-α、IFN-γ、IL-1β、IL-4、IL-10、IL-6、IL-13、IL-17的表達(dá)情況。結(jié)果:1成功培養(yǎng)出RSV,并測(cè)定病毒滴度107.86pfu/ml。2成功制備福爾馬林滅活疫苗(FI-RSV)、福爾馬林滅活加Al(OH)3疫苗和對(duì)照疫苗(FI-control)。3小鼠血清中特異性抗體Ig G及中和抗體測(cè)定結(jié)果各免疫組產(chǎn)生特異性Ig G、Ig G1和Ig G2a,抗體水平較Control組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。各免疫組產(chǎn)生的特異性Ig G、Ig G1和Ig G2a抗體水平與FI-control及FI-control+DMSO組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),FI-control與FI-control+DMSO組之間比較無差異。各免疫組誘導(dǎo)的Ig G和Ig G1無顯著差異,FI-RSV+Cp G+L-685,458組誘導(dǎo)的Ig G2a顯著高于其他各免疫組(P0.05);FI-RSV+Cp G+L-685,458組Ig G1/Ig G2a的比值(1.02)明顯低于各免疫組(P0.05),FI-RSV+Al(OH)3+L-685,458的比值(1.44)高于各免疫組,其它各組比較無差異。各免疫組產(chǎn)生的中和抗體水平顯著高于FI-control及FI-control+DMSO組(P0.05),FI-control與FI-control+DMSO組之間比較無差異。另外,FI-RSV組顯著高于FI-RSV+L-685,458(P0.05),FI-RSV+Al(OH)3組顯著高于FI-RSV+Al(OH)3+L-685,458(P0.05),FI-RSV+Cp G與FI-RSV+Cp G+L-685,458組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。4 RSV感染后小鼠的體重變化與Control組相比,FI-RSV+Cp G+L-685,458組在各時(shí)間點(diǎn)的體重變化均無顯著性差異(P0.05);而其他各免疫組在不同的時(shí)間點(diǎn)均有不同程度的下降,其中FI-RSV+Cp G和FI-RSV+L-685,458組在攻擊后第二天體重減低達(dá)到峰值,且顯著低于Control組(P0.05);FI-RSV、FI-RSV+Al(OH)3和FI-RSV+Al(OH)3+L-685,458組分別于攻毒后1、3和5天體重減少達(dá)到峰值,分別顯著低于Control組(P0.05);另外,與各免疫組相比FI-RSV+Cp G組體重下降最明顯,攻毒后1、2、3天均顯著低于其它各組(P0.05);FI-RSV+L-685,458與FI-RSV比較各時(shí)間點(diǎn)均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);FI-RSV+Al(OH)3+L-685,458組于1、2天均顯著高于FI-RSV+Al(OH)3組;FI-RSV+Al(OH)3與FI-RSV組各時(shí)間點(diǎn)均無顯著差異;這些結(jié)果說明:L-685,458單獨(dú)與FI-RSV聯(lián)用對(duì)體重減輕無影響,Cp G單獨(dú)作為佐劑加劇了體重減輕,而Cp G與L-685,458聯(lián)合作為FI-RSV的佐劑可完全糾正體重減輕;另外,Al(OH)3佐劑不能改善體重減輕,Al(OH)3與L-685,458聯(lián)合作為FI-RSV的佐劑可部分糾正體重減輕。5肺組織染色5.1 PAS染色的肺組織切片顯示與Control組相比FI-control組、FI-RSV組、FI-control+DMSO組、FI-RSV+Al(OH)3、FI-RSV+Al(OH)3+L-685,458 RSV攻擊后均呈現(xiàn)出不同程度的粘液分泌,其中FI-RSV+Al(OH)3、FI-RSV+Al(OH)3+L-685,458組呈現(xiàn)大量的粘液分泌,FI-RSV+Cp G、FI-RSV+Cp G+L-685,458組粘液分泌不明顯。5.2 HE染色的肺組織切片顯示Control組小鼠,肺泡壁結(jié)構(gòu)完整,無水腫,肺泡周圍僅有少量白細(xì)胞;FI-control、FI-control+DMSO組和FI-RSV組小鼠支氣管周圍、血管周圍和肺泡間質(zhì)炎性細(xì)胞增多,肺泡壁輕微增厚;FI-RSV+Cp G組、FI-RSV+Al(OH)3、FI-RSV+Al(OH)3+L-685,458與FI-RSV+L-685,458組小鼠經(jīng)RSV攻擊后肺部顯示炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),肺泡壁也明顯增厚,肺泡間甚至出現(xiàn)融合和水腫,并且偶見出血點(diǎn),其中多為淋巴細(xì)胞,有時(shí)可見單核-巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和嗜酸性性粒細(xì)胞等;FI-RSV+Cp G+L-685,458組肺泡間質(zhì)未見炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),肺泡壁正常,支氣管和血管周圍偶見少量炎癥細(xì)胞。6實(shí)時(shí)定量檢測(cè)細(xì)胞因子6.1檢測(cè)肺組織內(nèi)RSV管家基因RSV-N的表達(dá)量FI-control組、FI-control+DMSO組和FI-RSV組肺組織RSV-N基因的表達(dá)量顯著高于其他免疫組(P0.05);另外,FI-RSV+Cp G+L-685,458組的表達(dá)量顯著低于FI-RSV+Cp G組和FI-RSV+L-685,458組。6.2.1 IFN-γFI-RSV+Cp G、FI-RSV和FI-RSV+Al(OH)3組的IFN-γ顯著高于其它各組(P0.05)。6.2.2 IL-4Control組和FI-RSV+Al(OH)3+L-685,458組的IL-4明顯高于其它各組(P0.05),其他各組無顯著差異(P0.05)。6.2.3 IL-5IL-5的表達(dá)量FI-RSV+Cp G+L-685,458組顯著低于FI-RSV+Cp G組和FI-RSV+Al(OH)3組、FI-RSV+Al(OH)3+L-685,458組(P0.05)。6.2.4 IL-10FI-control組、FI-RSV組和FI-RSV+Al(OH)3+L-685,458組IL-10的表達(dá)量顯著高于其它各組(P0.05);另外,FI-RSV+Cp G+L-685,458組的表達(dá)量顯著低于FI-RSV+Cp G組(P0.05)。6.2.5 IL-13各免疫組IL-13的表達(dá)量顯著高于Control組(P0.05);另外,FI-RSV+Cp G+L-685,458組的表達(dá)量顯著低于FI-RSV+Cp G組、FI-RSV+L-685,458組(P0.05)。6.2.6 IL-1βFI-control組、FI-RSV+Cp G組IL-1β的表達(dá)量顯著高于其他各組(P0.05);另外,FI-RSV+Cp G+L-685,458組的表達(dá)量顯著低于FI-RSV組、FI-RSV+L-685,458組(P0.05)。6.2.7 IL-17FI-RSV+Cp G組IL-17的表達(dá)量顯著高于除FI-control組、FI-RSV組之外的其他各組(p0.05),FI-RSV組顯著高于FI-RSV+Al(OH)3+L-685,458組、FI-RSV+L-685,458組、FI-RSV+Cp G+L-685,458組(P0.05)。6.2.8 TNF-αFI-RSV+Al(OH)3+L-685,458組和FI-RSV+Al(OH)3組TNF-α的表達(dá)量顯著高于其他各組(P0.05);另外,FI-RSV+Cp G+L-685,458組的表達(dá)量顯著低于FI-RSV組、FI-RSV+Cp G組(P0.05)。6.2.9T-betFI-RSV+Cp G組T-bet的表達(dá)量顯著高于其他組(P0.05);FI-control+DMSO組的表達(dá)量顯著高于Control組(P0.05)。6.2.10 ROR-γtFI-RSV+Cp G組ROR-γt顯著高于其他各組(P0.05);FI-RSV+Cp G+L-685,458組的表達(dá)量顯著低于FI-RSV組、FI-RSV+L-685,458組(P0.05)。6.2.11GATA-3FI-RSV+Al(OH)3+L-685,458組和FI-RSV+Al(OH)3組GATA-3的表達(dá)量顯著高于其他各組(P0.05);FI-RSV+Cp G+L-685,458組的表達(dá)量顯著低于FI-RSV組、FI-RSV+Cp G組(P0.05)。7支氣管肺泡灌洗液細(xì)胞涂片7.1各免疫組小鼠支氣管肺泡灌洗液中的細(xì)胞總數(shù)和Control有顯著差異(P0.05),FI-RSV+Cp G組高于其他各組(P0.05);FI-RSV+Cp G+L-685,458組低于除FI-control組、FI-RSV組外的其他各組(P0.05)。7.2各免疫組小鼠感染RSV5天后支氣管肺泡灌洗液中的巨噬細(xì)胞比例和正常對(duì)照組有差異顯著(P0.05),FI-RSV+Cp G+L-685,458組顯著高于除FI-RSV+L-685,458組外的其他各組(P0.05)。7.3各免疫組小鼠感染RSV5天后支氣管肺泡灌洗液中的淋巴細(xì)胞百分?jǐn)?shù)和正常對(duì)照組有差異顯著(P0.05),FI-RSV+Cp G+L-685,458組顯著低于除FI-RSV+Al(OH)3+L-685,458組、FI-RSV+L-685,458組外的其他各組(P0.05)。7.4各免疫組小鼠感染RSV5天后支氣管肺泡灌洗液中的中性粒細(xì)胞百分?jǐn)?shù)和正常對(duì)照組有差異顯著(P0.05),FI-RSV+Cp G+L-685,458組顯著低于FI-RSV組、FI-RSV+Cp G組、FI-RSV+Al(OH)3組、FI-RSV+Al(OH)3+L-685,458組(P0.05)。8肺勻漿病毒滴定病毒滴定結(jié)果顯示:Control組未檢測(cè)到病毒;其余各免疫組有一定的病毒滴度,但各免疫組的病毒滴度均顯著低于FI-control組、FI-control+DMSO組(P0.05);FI-control組與FI-control+DMSO組的病毒滴度無顯著差異(P0.05)。9 ELISA檢測(cè)細(xì)胞因子9.1 IFN-γ各免疫組IFN-γ的表達(dá)量顯著高于Control組(P0.05);FI-RSV+Al(OH)3+L-685,458組、FI-RSV+Al(OH)3組、FI-RSV+Cp G+L-685,458組、FI-RSV+L-685,458組低于FI-control組(P0.05);另外,FI-RSV+Cp G+L-685,458組低于FI-RSV組、FI-RSV+Cp G組(P0.05)。9.2 IL-1βFI-RSV組IL-1β的表達(dá)量顯著高于其他各組;FI-RSV+Al(OH)3+L-685,458組低于FI-RSV+Cp G+L-685,458組(P0.05);FI-RSV+Cp G+L-685,458組低于FI-RSV+Cp G組(P0.05)。9.3 IL-4各免疫組IL-4的表達(dá)量顯著高于Control組(P0.05);FI-RSV+Cp G+L-685,458組低于FI-RSV組、FI-RSV+Cp G組(P0.05)。9.4 IL-6除FI-RSV+Al(OH)3+L-685,458組、FI-RSV+Cp G+L-685,458組外,各組IL-6表達(dá)量顯著高于Control組(P0.05);另外,FI-RSV+Cp G+L-685,458組低于FI-RSV組、FI-RSV+Cp G組(P0.05),FI-RSV+CPG組低于FI-RSV組(P0.05)。9.5 IL-10除FI-RSV+Al(OH)3+L-685,458組、FI-RSV+L-685,458組外,各組IL-10表達(dá)量顯著高于Control組(P0.05);另外,FI-RSV+Cp G+L-685,458組低于FI-RSV組、FI-RSV+Cp G組(P0.05)。9.6 IL-13除FI-control組、FI-RSV+Al(OH)3組、FI-RSV+Al(OH)3+L-685,458組外,各組IL-13表達(dá)量顯著高于Control組(P0.05),另外,FI-RSV+Cp G+L-685,458組低于FI-RSV組、FI-RSV+Cp G組(P0.05)。9.7 IL-17FI-RSV組、FI-RSV+Cp G組IL-17表達(dá)量顯著高于Control組、FI-control組、FI-control+DMSO組、FI-RSV+Al(OH)3+L-685,458組(P0.05);另外,FI-RSV+Cp G+L-685,458組低于FI-RSV組、FI-RSV+Cp G組(P0.05)。9.8TNF-α除FI-RSV+L-685,458組、FI-RSV+Al(OH)3+L-685,458組外其他各組TNF-α的表達(dá)量顯著高于Control組(P0.05);FI-RSV+L-685,458組低于FI-control組、FI-RSV組、FI-RSV+Cp G組、FI-control+DMSO組(P0.05);另外,FI-RSV+Cp G+L-685,458組低于FI-RSV組、FI-RSV+Cp G組(P0.05)。結(jié)論:1 Cp G與L-685,458作為聯(lián)合佐劑對(duì)Ig G抗體和中和抗體的效價(jià)無顯著影響,但可明顯增加Ig G2a的效價(jià),使Ig G1/Ig G2a更平衡。2 Cp G與L-685,458作為聯(lián)合佐劑對(duì)疫苗的保護(hù)性無顯著影響,即不降低疫苗的保護(hù)性。3 Cp G與L-685,458作為聯(lián)合佐劑可顯著減輕肺部免疫病理損傷,FI-RSV+Cp G+L-685,458組小鼠在RSV攻擊后未見疫苗增強(qiáng)性疾病,是FI-RSV疫苗的理想佐劑。4 Cp G與L-685,458聯(lián)合佐劑對(duì)疫苗免疫應(yīng)答的可能調(diào)節(jié)機(jī)制:通過TLR信號(hào)和Notch信號(hào)的互作,調(diào)節(jié)Th1、Th2和Th17型應(yīng)答平衡,從而調(diào)節(jié)肺部的炎癥應(yīng)答平衡。
【關(guān)鍵詞】：Notch信號(hào) CpG 佐劑 呼吸道合胞病毒疫苗 疫苗 疫苗增強(qiáng)型免疫病理
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R392
【目錄】：

• 中文摘要4-12
• 英文摘要12-22
• 英文縮寫22-23
• 前言23-25
• 材料與方法25-40
• 結(jié)果40-46
• 附圖46-62
• 附表62-63
• 討論63-64
• 結(jié)論64-65
• 參考文獻(xiàn)65-67
• 綜述67-81
• 參考文獻(xiàn)78-81
• 致謝81-82
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷82

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