TRIM21是三基序蛋白家族的成員之一,與多種病毒的復(fù)制增殖相關(guān),但其與EMCV感染的研究機(jī)制尚不明確。該研究采用脂質(zhì)體介導(dǎo)法將構(gòu)建成功的TRIM21的真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-TRIM21以及針對該靶點的小RNA干擾序列瞬時轉(zhuǎn)染至HEK293和HeLa細(xì)胞,探討細(xì)胞內(nèi)TRIM21的表達(dá)對腦心肌炎病毒復(fù)制增殖的影響,并進(jìn)一步進(jìn)行機(jī)制研究。結(jié)果顯示, TRIM21在細(xì)胞中成功過表達(dá); EMCV感染24 h后進(jìn)行檢測,結(jié)果證明,過表達(dá)TRIM21組病毒滴度、病毒拷貝數(shù)及病毒蛋白均低于對照組。RNA干擾實驗下調(diào)TRIM21后,病毒滴度、病毒拷貝數(shù)及病毒蛋白顯著高于對照組。此外,機(jī)制研究提示, TRIM21可正調(diào)節(jié)II型干擾素及促炎性因子IL-6的轉(zhuǎn)錄,從而抑制EMCV的增殖。以上結(jié)果表明, TRIM21與EMCV的復(fù)制增殖密切相關(guān),可能通過對IFN信號通路部分蛋白及促炎性因子的調(diào)控參與對病毒復(fù)制增殖的影響。 

【文章來源】：中國細(xì)胞生物學(xué)學(xué)報. 2019年12期

【文章頁數(shù)】：9 頁

【部分圖文】：

TRIM21下調(diào)對EMCV感染的影響

將外源基因轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞后提取RNA進(jìn)行基因水平的檢測。圖3A顯示,轉(zhuǎn)染組TRIM21基因表達(dá)較空載組顯著提高(P<0.001),提示外源TRIM21在基因水平成功表達(dá)。Western blot檢測結(jié)果顯示,與空載組相比,TRIM21的表達(dá)量隨著TRIM21濃度的增加而增加,呈劑量依賴性關(guān)系(圖3B),TRIM21瞬時過表達(dá)成功。圖2 TRIM21基因的擴(kuò)增及雙酶切驗證

圖1 EMCV感染細(xì)胞后TRIM21的表達(dá)量檢測瞬時過表達(dá)TRIM21后進(jìn)行EMCV感染實驗,接毒量為0.01 MOI。接毒后收集上清和細(xì)胞,檢測細(xì)胞胞內(nèi)和胞外的病毒滴度。結(jié)果顯示,隨著TRIM21濃度的增加,細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外病毒滴度也逐漸減少,當(dāng)TRIM21濃度為1.5μg時,病毒滴度顯著下降(圖3C和圖3D,P<0.05)。后期,本實驗嘗試用較高濃度的TRIM21質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)當(dāng)濃度高于1.5μg時對細(xì)胞活力產(chǎn)生了影響(結(jié)果未顯示)。為了驗證TRIM21在不同細(xì)胞中是否有相同的作用,在HeLa細(xì)胞中做了同樣的實驗。在基因(圖3E)和蛋白(圖3F)水平檢測TRIM21過表達(dá)后,EMCV VP1蛋白和EMCV 3D(圖3G)的表達(dá)被明顯抑制。這一結(jié)果提示,TRIM21的表達(dá)量與EMCV增殖呈負(fù)相關(guān)。

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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博士論文
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碩士論文
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本文編號：2952872