目的構(gòu)建幽門螺桿菌（Helicobacter pylori, Hp）金屬蛋白酶（metalloprotease, Mtp）基因mtp與麥芽糖結(jié)合蛋白基因mbp融合表達(dá)載體,誘導(dǎo)Mtp重組表達(dá)并純化表達(dá)產(chǎn)物,為Hp致病機制和疫苗研究奠定基礎(chǔ)。方法應(yīng)用PCR從Hp鄭州分離株MEL-Hp27的DNA擴增mtp基因,經(jīng)純化回收后與克隆載體pMD19-T連接,并進行測序驗證。對重組質(zhì)粒pMD19-T-mtp雙酶切,酶切目的片段克隆至表達(dá)載體pMAL-c2X,然后用重組質(zhì)粒pMAL-mtp轉(zhuǎn)化大腸埃希菌（E.coli TB1）。從大腸埃希菌重組子中提取重組質(zhì)粒,進行酶切和測序鑒定。用分光光度計測定重組菌的生長曲線。用IPTG誘導(dǎo)mtp表達(dá),用SDS-PAGE法分析表達(dá)產(chǎn)物,并用Amylose樹脂預(yù)裝柱純化Mtp蛋白。結(jié)果 PCR擴增的mtp基因片段長度為621 bp,重組菌株的酶切和測序鑒定正確;重組菌生長曲線顯示重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)入對受體菌的生長無顯著影響;Mtp誘導(dǎo)表達(dá)和純化產(chǎn)物的SDS-PAGE顯示,Mtp表達(dá)產(chǎn)物為相對分子質(zhì)量為66.4×10³的水溶性融合蛋白（rMtp）,... 

【文章來源】：中國病原生物學(xué)雜志. 2019年11期 北大核心

【文章頁數(shù)】：5 頁

【部分圖文】：

重組質(zhì)粒pMAL-mtp的酶切鑒定

將種子菌接種至LB培養(yǎng)基后,菌體開始生長并進入延遲期(續(xù)約2 h),菌體濃度增加較為平緩;此后進入對數(shù)生長期,菌體濃度隨時間呈指數(shù)增長;該菌株在第6 h進入穩(wěn)定期,菌體生長速率開始下降,并進入恒定期。再者,TB1、TB1/pMAL-c2X和TB1/pMAL-mtp菌株生長曲線基本一致,說明重組載體的轉(zhuǎn)入,并未影響受體菌的正常生長(圖2)。4 重組蛋白的表達(dá)誘導(dǎo)及純化產(chǎn)物的SDS-PAGE分析

陽性克隆子在IPTG誘導(dǎo)下表達(dá)的融合蛋白(rMtp)的相對分子質(zhì)量為66.4×103(MBP和Mtp的相對分子質(zhì)量分別為42.5×103和23.9×103)的,與預(yù)期基本相符(圖3)。Bandscan 5.0分析顯示,在培養(yǎng)工程菌2 h時加入0.3 mmol/L誘導(dǎo)劑,誘導(dǎo)5 h后表達(dá)量較高(28.4%)(圖4)。討 論

【參考文獻】：
期刊論文
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