目的本研究旨在構建并制備增強型熒光蛋白（EGFP）基因和Klotho基因重組腺病毒載體AdEGFP-Klotho,并將其感染HEK293細胞,為基因治療提供研究基礎。方法設計含有NheⅠ與NotⅠ雙酶切位點的引物,應用PCR方法擴增Klotho基因,將其連接到EGFP標記的pDC316-mCMV穿梭質粒上,構建重組穿梭質粒pDC316-mCMV-EGFP-Klotho,利用Polyfectin脂質體將骨架質粒和重組穿梭質粒共轉染HEK293細胞進行同源重組,得到重組腺病毒Ad-EGFP-Klotho,并包裝擴增,測定病毒顆粒數(shù)及滴度。采用PCR方法對重組腺病毒載體Ad-EGFP-Klotho進行鑒定,并進行Klotho基因測序。結果經(jīng)PCR和NheⅠ、NotⅠ雙酶切鑒定,重組腺病毒載體Ad-EGFP-Klotho中證實含有Klotho基因,測序結果和設計序列比對一致,重組腺病毒載體Ad-EGFP-Klotho構建成功。滴度為2.0×1010 Tu/mL,成功感染HEK293細胞,感染復數(shù)（MOI）=100,感染效率達91.75%,從Ad-EGFP-Klotho重組腺病毒載體中可以檢測到... 

【文章來源】：重慶醫(yī)學. 2019年23期 第3970-3973頁

【文章頁數(shù)】：4 頁

【部分圖文】：

重組穿梭質粒pDC316-CMV-EGFP-Klotho酶切鑒定結果

重組腺病毒Ad-EGFP-Klotho轉染HEK293細胞，轉染8d后細胞表現(xiàn)出CPE現(xiàn)象，置于熒光顯微鏡下觀察，可見大量表達EGFP，見圖3。圖3 Klotho和EGFP轉染后到獲得重組腺病毒的EGFP表達圖

Klotho和EGFP轉染后到獲得重組腺病毒的EGFP表達圖

【參考文獻】：
期刊論文
[1]重組腺病毒載體Ad5-hTRX-EGFP的構建及其表達[J]. 扈江偉,王軍,徐曼,蘇永鋒,孔維霞,盛紅霞,張斌,陳虎.  中國實驗血液學雜志. 2012(03)



本文編號：2909659