微小隱孢子蟲(chóng)（Cryptosporidium parvum）是隸屬于頂復(fù)合器門的專性腸道細(xì)胞內(nèi)寄生原蟲(chóng)，對(duì)免疫功能正常的宿主可引起自限性腹瀉，但是對(duì)免疫功能缺陷的宿主如艾滋病患者則具有潛在的生命威脅。目前，還沒(méi)有有效的藥物治療隱孢子蟲(chóng)感染，因此，疫苗研制是防控本病感染的一個(gè)重要策略。本研究應(yīng)用多個(gè)抗原表位預(yù)測(cè)軟件對(duì)微小隱孢子蟲(chóng)CP15、P23和CP15/60三個(gè)子孢子表面抗原的多肽序列進(jìn)行了T細(xì)胞表位預(yù)測(cè)及分析，從中選取了三個(gè)抗原表位富集的基因片段，利用重疊延伸PCR技術(shù)將該三個(gè)基因的全序列和三個(gè)篩選的表位富集片段序列分別進(jìn)行串聯(lián)，各基因片段之間以柔性氨基酸（GGGGS）的堿基序列連接，得到融合基因CP15-P23-CP15/60和CpTm，將其分別克隆到原核表達(dá)載體pET28（a+）上，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET-CP15-23-60和pET-CpTm，并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21（DE3）中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，將純化的重組蛋白分別免疫BALB/c小鼠制備多克隆抗體。結(jié)果顯示兩個(gè)融合基因在大腸桿菌中高效表達(dá)，Western blot分析顯示重組蛋白能被�？刮⑿‰[孢子蟲(chóng)陽(yáng)性血清及隱孢子蟲(chóng)鼠基因型CP... 

【文章來(lái)源】：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京市

【文章頁(yè)數(shù)】：89 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

重疊延伸PCR串聯(lián)擴(kuò)增三個(gè)目的基因片段Fig.2.1ConnectionofthreegenefragmentsbyoverlapextensionPCR

25為 1185 bp（圖 2.2-C），CpTm 融合基因的大小為 816 bp（圖 2.2-F），均與預(yù)期相符。圖2.2 融合基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果A：CP15、P23、CP15/60基因的PCR擴(kuò)增；B：融合基因CP15-P23的PCR擴(kuò)增；C：融合基因CP15-P23-CP15/60的PCR擴(kuò)增；D：P1、P2、P3基因的PCR擴(kuò)增；E：融合基因P1-2的PCR擴(kuò)增；F：融合基因CpTm的PCR擴(kuò)增；M：100bp DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；M1：DNA標(biāo)準(zhǔn)DL2000；1：CP15基因擴(kuò)增片段；2：P23基因擴(kuò)增片段；3：CP15/60基因擴(kuò)增片段；4：CP15-P23基因擴(kuò)增片段；5：CP15-P23-CP15/60基因擴(kuò)增片段；6：P1基因擴(kuò)增片段；7：P2基因擴(kuò)增片段；8：P3基因擴(kuò)增片段；9：P1-2基因擴(kuò)增片段；10：CpTm基因擴(kuò)增片段Fig. 2.2 Electrophoretic result of PCR product of fusion geneA: PCR amplification of CP15, P23 and CP15/60 genes; B: PCR amplification of CP15-P23 fusion gene; C: PCRamplification of CP15-P23-CP15/60 fusion gene; D: PCR amplification of P1, P2 and P3 genes; E: PCR amplification ofP1-2 fusion gene; F; PCR amplification of CpTm fusion gene; M: 100 bp DNA Ladder; M1: DNA Marker DL2000; 1:PCR product of CP15 gene; 2: PCR product of P23 gene; 3: PCR product of CP15/60 gene; 4: PCR product of CP15-P23fusion gene; 5: PCR product of CP15-P23-CP15/60 fusion gene;6: PCR product of P1 gene; 7: PCR product of P2 gene;8: PCR product of P3 gene; 9: PCR product of P1-2 fusion gene; 10: PCR product of CpTm fusion gene2.3.3 原核表達(dá)質(zhì)粒 pET-28a-CP15-23-60 和 pET-CpTm 的鑒定以菌液為模板，進(jìn)過(guò)25個(gè)循環(huán)的PCR擴(kuò)增，結(jié)果成功地重疊延伸PCR出了CP15-P23-CP15/60和 CpTm

鍯P15-P23-CP15/60基因及其主要抗原表位區(qū)的串聯(lián)表達(dá)26圖2.3 重組質(zhì)粒PCR鑒定電泳結(jié)果M：100 bp DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；M1：DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)Ⅳ；1：重組質(zhì)粒pET-CP15-23-60 的PCR產(chǎn)物；2：重組質(zhì)粒pET-CpTm的PCR產(chǎn)物Fig. 2.3 Electrophoretic result of recombinant plasmids identified by PCR ampliflicationM: 100 bp DNA Ladder; M1: DNA Marker Ⅳ; 1: PCR product of recombinant plasmid pET-CP15-23-60; 2: PCRproduct of recombinant plasmid pET-CpTm圖2.4 重組質(zhì)粒雙酶切產(chǎn)物的電泳結(jié)果M：DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)Ⅳ；1：pET-CP15-23-60重組質(zhì)粒EcoRⅠ、XhoⅠ雙酶切產(chǎn)物；2：pET-CpTm重組質(zhì)粒EcoR Ⅰ、SalⅠ雙酶切產(chǎn)物Fig. 2.4 Double restriction enzyme digestion analysis of recombinant plasmidsM: DNA Marker Ⅳ; 1: product of recombinant plasmid pET-CP15-23-60 digested by EcoRⅠand XhoⅠ; 2: product ofrecombinant plasmid pET-CpTm digested by EcoRⅠand SalⅠ2.3.4 重組質(zhì)粒 pET-28a-CP15-23-60 和 pET-CpTm 的誘導(dǎo)表達(dá)及純化將重組質(zhì)粒 pET-CP15-23-60 和 pET-CpTm 轉(zhuǎn)化入表達(dá)菌 BL21（DE3），經(jīng) IPTG（終濃度為1 mmol/L）37 ℃誘導(dǎo)表達(dá) 6 h，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng) SDS-PAGE 分析發(fā)現(xiàn) pET-CP15-23-60 的 5 號(hào)菌落和pET-CpTm 的 4 號(hào)菌落重組蛋白表達(dá)量較高（圖 2.5），重組表達(dá)蛋白大小分別約為 55 ku 和 43 ku；表達(dá)時(shí)相結(jié)果顯示兩個(gè)重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)超過(guò) 6 h 后表達(dá)量增多不明顯；不同表達(dá)形式分析結(jié)果顯示，兩個(gè)重組蛋白均為可溶性表達(dá)（圖 2.6）；表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)鎳柱純化后能得到較純的重組蛋白（圖2.7）。

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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碩士論文
[1]隱孢子蟲(chóng)Cp2/P30雙價(jià)核酸疫苗及亞單位疫苗的研究[D]. 李春雨.吉林大學(xué) 2010



本文編號(hào)：2902911