目的：探討miR-195調(diào)控LATS2對(duì)BEL-7402/5-FU細(xì)胞凋亡的影響及其作用機(jī)制。方法：MicroRNA（miRNA）芯片分析BEL-7402和BEL-7402/5-FU細(xì)胞miRNA的表達(dá)差異，靶基因預(yù)測(cè)軟件分析與LATS2基因相互作用的miRNA，篩選出miR-195為目的miRNA。將miR-195質(zhì)粒載體及其陰性對(duì)照質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染至BEL-7402/5-FU細(xì)胞；熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證miR-195調(diào)控的靶基因；倒置熒光顯微鏡和實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率；MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖情況，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率；實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)mRNA水平，Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)水平。結(jié)果：基因芯片檢測(cè)結(jié)果表明下調(diào)兩倍的miRNA有：miR-195，miR-18a，miR-122等，BEL-7402/5-FU比BEL-7402上調(diào)兩倍的miRNA有：miR-18和miR-224；結(jié)合芯片結(jié)果及利用生物信息學(xué)篩選出miR-195作為研究對(duì)象；倒置熒光顯微鏡和實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)，結(jié)果表明在miR-195轉(zhuǎn)染的BEL-7402/5-FU細(xì)胞中miR-195表達(dá)水... 

【文章來(lái)源】：南華大學(xué)湖南省

【文章頁(yè)數(shù)】：40 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

MicroRNA芯片分析BEL-7402和BEL-7402/5-FU細(xì)胞中miRNA表達(dá)情況

圖 1 MicroRNA 芯片分析 BEL-7402 和 BEL-7402/5-FU 細(xì)胞中 miRNA 表達(dá)情況*P<0.05 vs.BEL-7402/5-FU，Mean±SD，n=3二、生物信息學(xué)篩選目的 miRNA 并預(yù)測(cè)靶基因結(jié)合文獻(xiàn)及 microRNA 芯片結(jié)果篩選目的 miRNA，通過(guò) Microrna.org 和 Targetscan生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)靶基因。選取 miR-195 作為目的 miRNA 進(jìn)行研究。（圖 2）。

三、倒置熒光顯微鏡和實(shí)時(shí)定量 RT-PCR 檢測(cè) miR-195 轉(zhuǎn)染情況質(zhì)粒表達(dá)載體測(cè)序結(jié)果顯示 miR-195 序列位于載體 122-140bp 間，說(shuō)明載體構(gòu)建成功（圖 3）。miR-195 轉(zhuǎn)染 BEL-7402/5-FU 細(xì)胞后 48 小時(shí)，通過(guò)倒置熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染細(xì)胞的熒光情況，各轉(zhuǎn)染組的轉(zhuǎn)染率均大于 35%（圖 4）。實(shí)時(shí)定量 RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，miR-195 轉(zhuǎn)染組較未轉(zhuǎn)染組及陰性對(duì)照組的 miR-195 的表達(dá)明顯上調(diào)（圖 5）。

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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本文編號(hào)：2900423