細胞衰老是指在DNA損傷、端粒酶活性丟失等內(nèi)在因素和細胞間通訊改變、體液循環(huán)因子改變等外在條件的刺激下,細胞發(fā)生一系列形態(tài)結構的改變,導致細胞永久性退出分裂周期,無法發(fā)揮正常生理功能。而衰老細胞的累積會導致組織器官的衰老,進而引發(fā)組織器官衰老問題,如機體的結構和功能異常和各種衰老相關疾病的發(fā)生。肝臟是一個以代謝為核心功能的器官,而肝細胞是肝臟組織中最主要的實質(zhì)細胞。膽汁合成、肝糖貯存、脂質(zhì)代謝等多種肝功能都是由肝細胞來承擔的。隨著年齡增長,老年肝臟肝細胞的形態(tài)、結構和功能發(fā)生了一系變化,比如肝細胞體積變大,數(shù)量減少、增殖能力降低、肝細胞核出現(xiàn)空泡,胞質(zhì)出現(xiàn)脂褐素沉積、DNA含量異常,巨核肝細胞比例升高等。然而,由于衰老肝細胞的結構改變和功能異常,導致老年個體更容易發(fā)生各種肝臟疾病。比如老年個體容易出現(xiàn)肝臟脂肪性病變,老年小鼠中應對CCl_4等化學藥物的能力下降,肝臟的炎癥水平升高,加速肝臟纖維化病癥的發(fā)生發(fā)展。由此可見,肝細胞衰老與肝臟疾病發(fā)生發(fā)展緊密相關。因此,探尋肝細胞衰老逆轉(zhuǎn)的途徑是老年肝臟疾病治療的必然要求。然而由于肝臟衰老模型小鼠缺乏等各種困難,目前仍無法獲得肝細胞衰老逆轉(zhuǎn)的深入研究。本項目研究中,基于聯(lián)體共生模型,使得聯(lián)體的兩只小鼠可以共享彼此的血液微環(huán)境途徑而用來探討微環(huán)境對肝細胞衰老逆轉(zhuǎn)的作用。首先,我們分別建立了2月齡和24月齡小鼠間聯(lián)體(聯(lián)體的2月齡為Het-Y,聯(lián)體的24月齡小鼠為Het-O)、相同月齡的年輕小鼠間聯(lián)體(聯(lián)體的同月齡小鼠都稱為Iso-Y)和相同月齡的老年小鼠間聯(lián)體(聯(lián)體的老年小鼠都稱為Iso-O)3種聯(lián)體共生模型。通過流式分析結果顯示聯(lián)體小鼠間血液交換率接近50%。成功構建聯(lián)體共生模型后,使得聯(lián)體小鼠共同生活5周,然后分別對不同組聯(lián)體小鼠肝臟肝細胞進行生物學特征和肝細胞功能的分析,評價年輕微環(huán)境對衰老肝細胞逆轉(zhuǎn)的作用。細胞衰老相關指標的檢測結果顯示,在年輕血液微環(huán)境的作用下,與Iso-O小鼠相比,老年小鼠SA-β-gal陽性率從38.23%±1.86%降低到4.84%±0.71%;γ-H2A.X陽性率從53.98%±3.78%降低到15.46%±1.86%;衰老指標細胞周期抑制因子P53、P21和P16的表達明顯降低(p0.01);炎癥因子IL-1β、IL-6和IL-8的表達水平也降低(p0.01)。其次,老年小鼠肝臟多倍體肝細胞數(shù)量增加,而多倍體肝細胞發(fā)生衰老的可能性增加。通過肝細胞比例分析發(fā)現(xiàn),在年輕微環(huán)境的作用下,與Iso-O相比,老年小鼠八倍體肝細胞比例從33.35%±0.85%降低到15.97%±0.84%;二倍體肝細胞比例從7.41%±0.54%升高到27.27%±0.71%。進一步對肝細胞數(shù)目和大小進行分析,結果顯示,在年輕微環(huán)境作用下,相同視野范圍內(nèi),老年肝臟肝細胞數(shù)目從402±18個增加到617±42個,細胞面積也從645.99±32.72μm~2減小至356.93±22.33μm~2。前期的研究表明隨著年齡的增加肝細胞增殖能力降低,體現(xiàn)在小鼠肝臟肝切后肝臟再生能力減弱和衰老肝細胞移植后再殖能力的下降。然而老年小鼠在年輕小鼠血液的影響下,其增殖能力發(fā)生了明顯變化。原位肝組織增殖能力檢測和原代肝細胞體外短期培養(yǎng)結果都顯示,年輕微環(huán)境作用下,衰老肝細胞增殖能力得到恢復,增殖水平與年輕小鼠相類似。上述結果證實:在年輕微環(huán)境作用下,衰老肝細胞的衰老指標消失了,衰老肝細胞的形態(tài)、結構發(fā)生了衰老逆轉(zhuǎn),且重新獲得了類似年輕肝細胞的增殖潛能。.衰老肝細胞發(fā)生系列形態(tài)結構和功能的改變,導致其對外界刺激的耐受力下降,因而慢性肝炎、肝纖維化、肝癌等肝臟疾病在老年個體中發(fā)生機會增加。隨著年齡的增長,衰老肝細胞出現(xiàn)脂質(zhì)代謝障礙,肝臟內(nèi)脂肪累積的水平提高,老年肝臟脂肪病變的發(fā)生幾率明顯增加。在聯(lián)體共生模型中,我們發(fā)現(xiàn)老年小鼠在年輕血液微環(huán)境的調(diào)控下,老年肝臟脂肪累積程度得到明顯的緩解。肝臟脂滴原位染色結果顯示,年輕微環(huán)境的作用下,于Iso-O相比較,油紅O的陽性面積從24.01%±3.48%降低到4.15%±2.95%,且尼羅紅的陽性面積也降低4倍。血清學指標也顯示老年小鼠TG、膽固醇和LDL-c水平明顯降低(p0.01),且肝損傷指標ALT和AST的表達水平也降低(p0.01)。綜合上述實驗結果,我們可以得出結論:在年輕血液微環(huán)境的作用下,老年衰老肝細胞的衰老表型發(fā)生逆轉(zhuǎn),多倍體肝細胞比例降低,增殖能力得到提高。而且年輕血液微環(huán)境促進了衰老肝細胞脂肪累積水平的降低,不僅提高了肝細胞的脂質(zhì)代謝能力,也改善了衰老肝臟的肝功能水平。這一重要發(fā)現(xiàn),為解決衰老肝細胞增殖緩慢和老年個體肝衰竭相關疾病高頻病發(fā)而難治愈問題提供新的思路,也為理解衰老和微環(huán)境的關系、衰老肝細胞發(fā)生“返老還童”機制和延緩或有效控制肝細胞衰老提供了理論基礎。
【學位單位】：中國人民解放軍海軍軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R-332;R575
【部分圖文】：

從而實現(xiàn)細胞的衰老逆轉(zhuǎn)已經(jīng)分別在大腦、骨骼肌、心臟、腎臟、胰腺等器官中得到運用（圖1）。（二）聯(lián)體共生模型下細胞衰老逆轉(zhuǎn)的研究進展脫髓鞘是一種老年神經(jīng)系統(tǒng)疾病，發(fā)病原因在于老年少突膠質(zhì)前體細胞（OPC）

-圖 2 聯(lián)體共生小鼠模型的構建：聯(lián)體小鼠模型構建及分析的技術路線；B、C：聯(lián)體 2 周時，兩只小鼠協(xié)調(diào)配合，共同；D：三種聯(lián)體模型小鼠體重的變化情況。Iso-Y 表示 2 月齡小鼠和 2 月齡小鼠聯(lián)體組合so-O 表示 24 月齡小鼠和 24 月齡小鼠聯(lián)體組合，Het 表示 2 月齡小鼠和 24 月齡小鼠聯(lián)體。

士學位論文聯(lián)體共生模型成功建立的評價體系聯(lián)體模型的有效性，我們將野生型 2 月齡 C57BL/6 小鼠與表達 GFP 的 2 月齡轉(zhuǎn)基因小鼠進行聯(lián)體。取聯(lián)體 5 周后的行流式分析。結果如圖 3 所示，聯(lián)體前，野生型小鼠中不細胞，而轉(zhuǎn)基因小鼠 99%以上細胞都帶有綠色熒光標記。帶綠色熒光的細胞進入野生型小鼠體內(nèi)，野生型小鼠中的了轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)，說明聯(lián)體兩只小鼠之間可以建立毛細體 5 周時，聯(lián)體小鼠間完成血液交換，血細胞交換率接近體模型可以用來研究年輕微環(huán)境對老年小鼠的影響。
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本文編號：2891824