為研究環(huán)鳥苷酸-腺苷酸合成酶入核的機制,利用兔外周血B細胞篩選抗人cGAS蛋白單克隆抗體.針對已三次免疫人cGAS(161-522)蛋白的新西蘭兔,運用流式細胞術(shù)得到陽性效應(yīng)B細胞,在單管里對單細胞裂解,得到總RNA,逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA,兩步巢式PCR擴增同一個B細胞來源的抗體重鏈和輕鏈可變區(qū)序列,抗體基因擴增成功率高達80%以上.293T重組表達兔抗人cGAS蛋白單克隆抗體并鑒定,獲得1個具有較好結(jié)合特異性的兔抗人cGAS蛋白單克隆抗體,ELISA檢測結(jié)果顯示抗體的效價達1∶10 000.
【部分圖文】：

??甲芟赴???30.6%;最后在第四個象限圈出P5，P5是P4門的子門，即CD4-/CD8-/Tlymphosite-/IgM-/IgG+/anti-cGAS+B細胞，P5中有127個細胞，占總細胞數(shù)的0.9%．通過分析之后的結(jié)果進行分選，最終將P5的細胞從流式細胞儀中分選出來，約占所有PBMC的1.3%．2.2兔抗體重鏈和輕鏈可變區(qū)序列的獲得將單個B細胞進行ＲNA提取，cDNA反轉(zhuǎn)錄后，用設(shè)計和整理的一套巢式擴增引物對cDNA進行擴增，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示經(jīng)過兩輪PCＲ后，均能獲得目的大小的條圖2流式分選術(shù)分選CD4-/CD8-/Tlymphosite-/IgM-/IgG+/anti-cGAS+B細胞Fig.2CellsortingofCD4-/CD8-/Tlymphosite-/IgM-/IgG+/anti-cGAS+BcellsbyFACS帶，結(jié)果見圖3．將其割膠回收，重鏈可變區(qū)克隆于PFUSEss-CHIg-rG-03，輕鏈可變區(qū)克隆于PFUSE2ss-CLIg-rk1質(zhì)粒，通過Sanger測序，驗證抗體序列的重鏈和輕鏈信息．得到24個B細胞的重鏈和輕鏈可變區(qū)序列信息，以克隆23測序數(shù)據(jù)為例，其使用IMGT數(shù)據(jù)庫(http:∥www.imgt.org/)可以比對到一個抗體的重鏈和輕鏈的可變區(qū)序列信息，其中重鏈氨基酸序列比對信息顯示:V區(qū)使用的是胚系IGHV1S7*01基因，D區(qū)基因使用的是IGHD2-1*01;J區(qū)基因使用的是胚系IGHJ4*01基因，結(jié)果見表1;而輕鏈基因比對信息顯示:V區(qū)基因使用的是胚系IGKV1S37*01基因，J區(qū)使用的是胚系IGKJ1-2*01基因，結(jié)果見表2．圖3單個B細胞使用重輕鏈引物擴增的第二輪PCＲ結(jié)果Fig.3SecondＲoundPCＲproductsofVH，V-KAPPAdomaingenesfromsingleBcell表1克隆23中兔Ig重鏈可變區(qū)胚系基因Tab.1Ｒabbitgerm

第6期傅雅娟，等:從單個兔B細胞獲得抗人cGAS蛋白單克隆抗體2.3抗人cGAS抗體的表達及鑒定將重組重鏈表達載體和輕鏈表達載體匹配，轉(zhuǎn)染293T細胞表達抗體，收取細胞上清檢測抗體效價，結(jié)果見圖4．結(jié)果顯示24個抗體中，克隆19，20，21，22，23能特異性和人cGAS(161－522)蛋白結(jié)合．為進一步確定抗體效價，將抗體克隆23進行梯度稀釋，結(jié)果見圖5，ELISA結(jié)果檢測發(fā)現(xiàn)抗體克隆23滴度達到在1∶10000，具有良好的活性．圖4ELISA測定細胞上清表達抗體效價Fig.4MeasurementofantibodyserumtiterofcellculturemediumbyELISA圖5ELISA檢測B細胞克隆23的抗體效價Fig.5MeasurementantibodytiterofBcellclone23byELISA3討論從兔外周血B細胞中篩選兔單克隆抗體的技術(shù)，較傳統(tǒng)雜交瘤方法具有明顯的優(yōu)勢．使用單B細胞技術(shù)擴增單克隆抗體，可省略B細胞擴增培養(yǎng)的時間，更快速地獲得有效的抗體;同時也極大的節(jié)約成本．該方法不依賴于飼養(yǎng)細胞，因此它不僅可應(yīng)用于兔外周血B細胞，還可以應(yīng)用于多個物種，包括小鼠、人類等［25］．單個B細胞抗體技術(shù)制備技術(shù)已經(jīng)成為制備抗體的熱門方法．隨著B細胞的分選技術(shù)、PCＲ擴增方法以及抗體特異性、親和力鑒定方法的成熟和完善，未來單個B細胞抗體制備技術(shù)將在診斷、臨床應(yīng)用中發(fā)揮重大的作用．環(huán)狀GMP-AMP合成酶(cyclicGMP-AMPsynthase，cGAS)是細胞內(nèi)重要的DNA感受器，可激活下游的炎癥通路．最近研究表明，用依托泊苷(etoposide)、喜樹堿(camptothecin)和過氧化氫(H2O2)三種藥物處理三種人成纖維細胞?

cGAS抗體的表達及鑒定將重組重鏈表達載體和輕鏈表達載體匹配，轉(zhuǎn)染293T細胞表達抗體，收取細胞上清檢測抗體效價，結(jié)果見圖4．結(jié)果顯示24個抗體中，克隆19，20，21，22，23能特異性和人cGAS(161－522)蛋白結(jié)合．為進一步確定抗體效價，將抗體克隆23進行梯度稀釋，結(jié)果見圖5，ELISA結(jié)果檢測發(fā)現(xiàn)抗體克隆23滴度達到在1∶10000，具有良好的活性．圖4ELISA測定細胞上清表達抗體效價Fig.4MeasurementofantibodyserumtiterofcellculturemediumbyELISA圖5ELISA檢測B細胞克隆23的抗體效價Fig.5MeasurementantibodytiterofBcellclone23byELISA3討論從兔外周血B細胞中篩選兔單克隆抗體的技術(shù)，較傳統(tǒng)雜交瘤方法具有明顯的優(yōu)勢．使用單B細胞技術(shù)擴增單克隆抗體，可省略B細胞擴增培養(yǎng)的時間，更快速地獲得有效的抗體;同時也極大的節(jié)約成本．該方法不依賴于飼養(yǎng)細胞，因此它不僅可應(yīng)用于兔外周血B細胞，還可以應(yīng)用于多個物種，包括小鼠、人類等［25］．單個B細胞抗體技術(shù)制備技術(shù)已經(jīng)成為制備抗體的熱門方法．隨著B細胞的分選技術(shù)、PCＲ擴增方法以及抗體特異性、親和力鑒定方法的成熟和完善，未來單個B細胞抗體制備技術(shù)將在診斷、臨床應(yīng)用中發(fā)揮重大的作用．環(huán)狀GMP-AMP合成酶(cyclicGMP-AMPsynthase，cGAS)是細胞內(nèi)重要的DNA感受器，可激活下游的炎癥通路．最近研究表明，用依托泊苷(etoposide)、喜樹堿(camptothecin)和過氧化氫(H2O2)三種藥物處理三種人成纖維細胞，均發(fā)現(xiàn)DNA損傷可使cGAS核轉(zhuǎn)位增加．Co-IP實驗提示cGAS的核轉(zhuǎn)位可能
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