目的分析脂肪基質(zhì)細(xì)胞(Adipose-derived stromal cells,ADSC)誘導(dǎo)分化為星形膠質(zhì)細(xì)胞過程中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(Endoplasmic reticulum stress,ERS)的特征,從而明確ERS在這種誘導(dǎo)分化反應(yīng)中的作用。方法1將ADSC從成人離體脂肪組織中提取后,進(jìn)行傳代與培養(yǎng),選取生長狀態(tài)良好的第3代ADSC,用DE-1誘導(dǎo)劑對其進(jìn)行誘導(dǎo)分化,獲得未誘導(dǎo)組及誘導(dǎo)48h、7d、14d、21d組細(xì)胞。倒置相差顯微鏡觀察不同誘導(dǎo)時(shí)間組細(xì)胞的形態(tài)變化,并攝片存檔。2免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)檢測ADSC未誘導(dǎo)組及各時(shí)間誘導(dǎo)組膠質(zhì)纖維酸性蛋白(Glial fibrillary acidic protein,GFAP)、雙鏈RNA依賴的蛋白激酶樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(PKR-like ER kinase,PERK)、活化轉(zhuǎn)錄因子6(Activating transcription factor6,ATF6)、葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白(Glucose-regulated protein,GRP78/BiP)、和細(xì)胞凋亡蛋白增強(qiáng)子結(jié)合蛋白同源蛋白(Enhancer-binding protein-homologous proein,CHOP/GADDl53)、半胱天冬氨酸蛋白酶12(Cysteme aspartate specific protease 12,Caspase12)和半胱天冬氨酸蛋白酶3(Cysteme aspartate specific protease 3,Caspase3)的表達(dá)情況。3 Western-blotting法定量檢測ADSC在未誘導(dǎo)組及各時(shí)間誘導(dǎo)組中GFAP、PERK、ATF6、GRP78、CHOP、Caspase12和Caspase3的表達(dá)水平。4免疫熒光化學(xué)法檢測ADSC向星形膠質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)過程中GFAP與PERK、ATF6、GRP78、CHOP、Caspase12和Caspase3的共表達(dá)特征。5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:將全部實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)應(yīng)用Excel 2007建立數(shù)據(jù)庫,應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對全部數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(sx±)表示,各組不同時(shí)間點(diǎn)間的比較采用單因素方差分析(one way ANOVA),各誘導(dǎo)水平之間的多重比較(兩兩比較)用LSD進(jìn)行檢驗(yàn),以P0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果1原代ADSC培養(yǎng)24h呈類圓形、錐形或短棒狀,均勻貼壁生長;第3代第5天的ADSC呈長梭形,纖維細(xì)胞狀,兩端長突起纖細(xì)變長;ADSC誘導(dǎo)48h時(shí)形態(tài)不規(guī)則,兩端長突起回縮,胞體伸出少量短小突起。誘導(dǎo)第7d時(shí),胞體呈類圓形,突起變長,且數(shù)量增多,圍繞胞體呈放射狀生長。誘導(dǎo)14d時(shí),胞體呈圓形或不規(guī)則形,胞體突起更加纖長,末端分叉生長。誘導(dǎo)21d時(shí)大部分ADSC凋亡,胞體的細(xì)胞膜破裂,突起回縮、斷裂、數(shù)量減少。2免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測發(fā)現(xiàn),ADSC未誘導(dǎo)組不表達(dá)GFAP,誘導(dǎo)48h、7d、14d、21d組均有陽性表達(dá)細(xì)胞,且其細(xì)胞陽性表達(dá)率在誘導(dǎo)14d明顯高于其它各組(均P0.001),PERK、ATF6和GRP78在未誘導(dǎo)組和誘導(dǎo)各時(shí)間組均有陽性表達(dá)細(xì)胞,未誘導(dǎo)組細(xì)胞陽性表達(dá)率明顯高于誘導(dǎo)各時(shí)間組,且隨誘導(dǎo)時(shí)間延長而明顯逐漸降低(均P0.001),CHOP、Caspase12和Caspase3在各組細(xì)胞組均可見陽性表達(dá),而且其細(xì)胞陽性表達(dá)率隨誘導(dǎo)時(shí)間的增長而逐漸增高,均在未誘導(dǎo)組最低,在誘導(dǎo)21d組最高(均P0.001)。3 Western-blotting法定量檢測發(fā)現(xiàn),未誘導(dǎo)組沒有GFAP表達(dá),誘導(dǎo)14d組表達(dá)水平明顯高于48h、7d、21d組(均P0.001);各組均檢測到PERK、ATF6、GRP78、CHOP、Caspase12和Caspase3的表達(dá),PERK在未誘導(dǎo)組表達(dá)水平明顯高于其它各組(P0.001),各組之間兩兩比較均有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(均P0.05),ATF6和GRP78的表達(dá)在未誘導(dǎo)組達(dá)峰值(均P0.001),誘導(dǎo)7d組與48h組無差異,其余各組間兩兩比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(均P0.05),CHOP表達(dá)水平在誘導(dǎo)21d組明顯高于其它各時(shí)間組(均P0.01),Caspase12表達(dá)水平在未誘導(dǎo)組與誘導(dǎo)48h組之間無差異,在誘導(dǎo)7d組與14d組之間也無差異性,但在其余各組之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P0.05),Caspase3表達(dá)水平在誘導(dǎo)14d組與7d組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,其余各組之間均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異性(均P0.05)。4免疫熒光化學(xué)法檢測結(jié)果顯示,在未誘導(dǎo)組無GFAP的綠色熒光陽性表達(dá),但可見PERK、ATF6、GRP78、CHOP、Caspase12和Caspase3的紅色熒光陽性表達(dá)。在誘導(dǎo)48h、7d、14d、21d組均可見GFAP/GRP78、GFAP/PERK、GFAP/ATF6、GFAP/CHOP、GFAP/Caspase12和GFAP/Caspase3的熒光共定位陽性表達(dá)。PERK、ATF6和GRP78的細(xì)胞陽性表達(dá)率隨誘導(dǎo)反應(yīng)時(shí)間延長而降低,未誘導(dǎo)組明顯高于其它時(shí)間組(均P0.01),CHOP、Caspase12和Caspase3的細(xì)胞陽性表達(dá)率則隨誘導(dǎo)時(shí)間延長而升高,在未誘導(dǎo)組最低,在誘導(dǎo)21d組最高(均P0.01)。結(jié)論在ADSC誘導(dǎo)分化為星形膠質(zhì)細(xì)胞的過程中發(fā)生了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,且內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激引發(fā)的由ATF6和PERK信號通路介導(dǎo)的未折疊蛋白反應(yīng)明顯減弱,而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡明顯增強(qiáng),特別是在誘導(dǎo)14d后急劇增加,是導(dǎo)致分化細(xì)胞死亡的主要原因。
【學(xué)位單位】：華北理工大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R329.2
【文章目錄】：
摘要
abstract
英文縮略表
引言
第1章 實(shí)驗(yàn)研究
    1.1 材料與方法
        1.1.1 材料
        1.1.2 實(shí)驗(yàn)方法
    1.2 結(jié)果
        1.2.1 ADSC的培養(yǎng)和誘導(dǎo)為星形膠質(zhì)細(xì)胞過程中的細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化特征
        1.2.2 免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測ADSC向星形膠質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)過程中GFAP,PERK,ATF6,GRP78,CHOP,Caspase12和Caspase3的表達(dá)結(jié)果
        1.2.3 Western-blotting法檢測ADSC向星形膠質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)過程中GFAP、PERK、ATF6、GRP78、CHOP、Caspase12和Caspase3的表達(dá)水平
        1.2.4 免疫熒光化學(xué)法檢測ADSC向星形膠質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)過程中GFAP與PERK,ATF6,GRP78,CHOP,Caspase12和Caspase3共表達(dá)特征
    1.3 討論
    1.4 結(jié)論
    參考文獻(xiàn)
第2章 綜述 ADSC源性星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激研究進(jìn)展
    2.1 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)
        2.1.1 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的起始-未折疊蛋白反應(yīng)
        2.1.2 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的監(jiān)測者-葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白
    2.2 .內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的促細(xì)胞存活通路
        2.2.1 PERK介導(dǎo)的生存信號PERK-eIF2α途徑
        2.2.2 IRE1信號生存通路IRE1-XBP1途徑
        2.2.3 ATF6途徑
    2.3 .內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的促細(xì)胞凋亡通路
        2.3.1 轉(zhuǎn)錄因子CHOP/GADD153的激活
        2.3.2 c-Jun氨基末端激酶的激活
        2.3.3 Caspase12蛋白酶途徑的激活
        2.3.4 B淋巴細(xì)胞瘤-2家族成員和鈣離子信號
    2.4 結(jié)語
    參考文獻(xiàn)
結(jié)論
附錄 圖片
致謝
導(dǎo)師簡介
作者簡介
學(xué)位論文數(shù)據(jù)集

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2882042