登革病毒(Dengue virus,DENV)是一種重要的蚊媒傳染病病毒。登革病毒主要通過埃及伊蚊和白紋伊蚊的叮咬在人群中擴(kuò)散,引起的臨床癥狀輕重不一,從溫和的登革熱(Dengue fever,DF)到嚴(yán)重的登革出血熱(Dengue hemorrhagic fever,DHF)和登革休克綜合征(Dengue shock syndrome,DSS),其中以登革熱病例最常見。全球128個國家有25億人面臨登革病毒感染的風(fēng)險,每年感染者中大約有50萬人需要住院治療,病死率在2.5%左右。熱帶和亞熱帶地區(qū)是登革病毒感染流行的主要區(qū)域,我國南部的廣東、海南和云南都屬于疫區(qū),幾乎每年都有登革病毒感染病例,其中2014年我國廣東省爆發(fā)登革熱疫情,感染病例達(dá)到46864人,其中6人死亡,造成嚴(yán)重的公共衛(wèi)生安全問題。目前針對登革病毒感染的防治藥物匱乏。賽諾菲-巴斯德公司研制的四價減毒活疫苗Dengvaxia從2015年底開始在墨西哥、菲律賓和巴西等三個國家獲得批準(zhǔn)使用,但是由于保護(hù)效果不理想且可能會對登革病毒血清抗體反應(yīng)為陰性的人群造成更嚴(yán)重的后果,2017年底菲律賓衛(wèi)生當(dāng)局已經(jīng)要求停止接種該疫苗。此外,目前市場上還沒有登革病毒感染的特效治療藥物,臨床上主要以對癥治療為主。因此,需要開發(fā)更有效的對抗登革病毒感染的防治手段。針對埃博拉、呼吸道合胞病毒感染的臨床實踐已經(jīng)證明中和抗體是一種有效的應(yīng)對病毒感染的治療方法,研究表明抗登革病毒的中和抗體也可以快速有效地中和小鼠體內(nèi)的登革病毒,達(dá)到抑制病毒增殖的目的,所以利用抗登革病毒中和抗體治療登革病毒感染,應(yīng)該是一種理想而有效的抗登革感染治療策略�；趩渭�(xì)胞PCR的抗體篩選制備方案是最近幾年發(fā)展起來的一種全人源的抗體制備技術(shù),其基本原理是采集患者或者疫苗免疫人群的外周血并分離單個B細(xì)胞,PCR擴(kuò)增單個細(xì)胞的抗體基因,進(jìn)行表達(dá)和篩選。該技術(shù)可以快速獲得全人源抗體,而且所獲得的抗體經(jīng)過了體內(nèi)親和力成熟,具有非常大的優(yōu)勢。為了快速獲取抗登革病毒的抗體,本研究采用單B細(xì)胞抗體制備技術(shù),利用從恢復(fù)期登革熱患者外周血中分選得到的抗體分泌細(xì)胞擴(kuò)增抗體基因,開展了針對登革病毒的中和抗體的研制工作。本研究首先從3例恢復(fù)期登革熱患者采集了30mL外周血,利用密度梯度沉降法,分離淋巴細(xì)胞,然后根據(jù)B細(xì)胞表面分子標(biāo)記對分離獲得的淋巴細(xì)胞進(jìn)行熒光標(biāo)記,流式細(xì)胞術(shù)分選CD19~(high)/CD20~(low to negative)/CD3~(negative)/CD27~(high)/CD38~(high)的單B細(xì)胞,共計1056個。通過反轉(zhuǎn)錄PCR和巢式PCR兩步從單B細(xì)胞中擴(kuò)增抗體基因,最終獲得了496個H鏈,707個κ鏈,222個λ鏈可變區(qū)基因片段,經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)輕重鏈配對的共有285對,占初始細(xì)胞總數(shù)的27%左右,其中輕鏈為?的有223對,輕鏈為λ的有62對。隨后將擴(kuò)增獲得的基因插入表達(dá)載體構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒,轉(zhuǎn)染FreeStyle~TMM HEK293-F細(xì)胞進(jìn)行抗體表達(dá),成功表達(dá)261株抗體。以滅活的四種血清型的登革病毒等量混合作為抗原,通過ELISA篩選獲得88株可以特異結(jié)合滅活的登革病毒的抗體,陽性率為33.7%。進(jìn)一步的體外中和活性評價顯示有24株抗體在濃度為10μg/m L時可以中和50%以上的DENV-1,其中1G5、3A6、6B1和9C7的中和活性最好,1G5和9C7的抑制率達(dá)到100%,3A6和6B1也都在95%以上。根據(jù)抗體對DENV-1體外中和活性評價的結(jié)果,我們選取中和活性最好的四株抗體進(jìn)行了親和力、交叉保護(hù)效果及體內(nèi)外活性評價。以滅活病毒為抗原,利用ELISA評價抗體的親和力,結(jié)果顯示1G5對DENV-1的親和力較高,基本不與其他三種血清型病毒結(jié)合,3A6、6B1和9C7則均可結(jié)合四種血清型登革病毒,只是9C7對DENV-4的親和力較低,6B1對DENV-3和DENV-4的親和力較低。隨后我們利用蛋白免疫印跡初步分析四株抗體所識別的病毒抗原,結(jié)果顯示其中三株抗體(1G5、6B1和9C7)識別登革病毒的E蛋白,而3A6識別登革病毒的prM蛋白。另外,1G5和9C7均不結(jié)合原核表達(dá)的重組E蛋白,推測這兩株抗體識別的抗原表位可能是空間表位,也可能是具有糖基化等修飾的表位;6B1既可以識別病毒的E蛋白,又可以識別重組E蛋白,推斷6B1結(jié)合的位點可能是E蛋白上的線性表位。體外中和實驗結(jié)果顯示1G5針對DENV-1有非常好的保護(hù)效果,與其他三種血清型的病毒沒有交叉保護(hù)效果;9C7、3A6和6B1可以同時中和四種血清型的病毒,但是9C7的中和活性比3A6和6B1高10倍以上,因此我們選擇1G5和9C7進(jìn)行了體內(nèi)抗病毒活性評價。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)1G5可有效預(yù)防和治療致死劑量的DENV-1對乳鼠的攻擊。9C7可有效預(yù)防和治療致死劑量的四種血清型登革病毒對乳鼠的攻擊。登革病毒抗體引起的抗體依賴的感染增強(qiáng)作用(antibody dependent enhancment,ADE)是限制其臨床應(yīng)用的重要因素,我們利用K562細(xì)胞作為感染模型檢測抗體依賴的感染增強(qiáng)效果,結(jié)果顯示:1G5和9C7在亞中和濃度時,均可增強(qiáng)登革病毒的感染,產(chǎn)生ADE作用。為了降低這兩株候選抗體的ADE活性,我們分別在其Fc段引入突變,檢測結(jié)果顯示改構(gòu)后的抗體分子在亞中和濃度時對登革病毒的感染增強(qiáng)作用均顯著降低或消除。Ⅰ型和Ⅱ型干擾素受體基因缺失(Ifnar1~(-/-)Ifngr1~(-/-))的免疫缺陷模型小鼠是登革病毒感染和評價抗體體內(nèi)抗病毒活性的首選模型動物。我們利用CRISPR-Cas9技術(shù)成功構(gòu)建Ifnar1~(-/-)Ifngr1~(-/-)的免疫缺陷模型小鼠,為抗登革病毒中和抗體研制工作的進(jìn)一步順利開展奠定了基礎(chǔ)。綜上所述,本研究建立了從單個B細(xì)胞制備抗體的方法,可以從感染患者或疫苗免疫人群的外周血中快速高效的制備中和抗體,研究篩選到2株具有良好的體內(nèi)外中和活性的抗登革病毒全人源單克隆抗體,抗體經(jīng)過改造后,已檢測不到明顯的ADE作用,經(jīng)過進(jìn)一步的評價和優(yōu)化,具有開發(fā)為治療登革病毒感染的被動免疫制劑的潛力。
【學(xué)位單位】：軍事科學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R392
【部分圖文】：

圖 1 DENV 基因組 RNA 所編碼的 10 個蛋白質(zhì)[8]DENV 的基因組是 11Kb 的單股正鏈 RNA，編碼 3 個結(jié)構(gòu)蛋白（包膜蛋白 E、前體蛋白 prM 和衣殼蛋白 C）和 7 個非結(jié)構(gòu)蛋白（NS）[9]，如圖 1 所示。位于毒顆粒內(nèi)部的C蛋白富含賴氨酸和精氨酸，與基因組RNA結(jié)合而發(fā)揮保護(hù)作用。毒顆粒表面展示的是 prM 蛋白和 E 蛋白，這兩種糖蛋白均是 DENV 重要的保護(hù)

圖 2 DENV E 蛋白結(jié)構(gòu)及其在成熟病毒顆粒上的排列[18]注： A：成熟病毒顆粒表面 E 蛋白的結(jié)構(gòu)，6 個 E蛋白排列形成 3 個二聚體結(jié)構(gòu)，綠色標(biāo)的是融合肽；B：E 蛋白由胞外區(qū)、兩個親性螺旋和保守的莖區(qū)以及兩個跨膜螺旋組成，紅、黃、藍(lán)依次代表胞外區(qū)的結(jié)構(gòu)域 I、結(jié)構(gòu)域 II 和結(jié)構(gòu)域 III。在病毒的感染過程中，DENV 首先附著于宿主細(xì)胞膜表面，并通過受體介導(dǎo)

圖 3 DENV的生命周期[8, 18]V 病毒顆粒結(jié)合特定的受體并通過網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用進(jìn)入宿主細(xì)宿主細(xì)胞膜在低 pH 的情況下融合，將病毒 RNA 釋放到宿主細(xì)胞質(zhì)中和翻譯，病毒顆粒在 ER 中進(jìn)行組裝，在 TGN 中進(jìn)行翻譯后修飾和加粒被胞吐釋放。在 DENV 生命周期的不同階段，病毒顆粒存在三種重）不成熟病毒顆粒，2）成熟病毒顆粒和 3）融合后構(gòu)象。B）prM 蛋白
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