目的:日本血吸蟲酪氨酸3-/色氨酸5-單加氧酶激活蛋白基因(Schistosoma japonicum tyrosine 3-monooxygenase/tryptophan 5-monooxygenase activation protein,SjTAP),已知可能是具有抗血吸蟲感染的免疫保護性基因;同時,SjTAP是在與釘螺組織共培養(yǎng)日本血吸蟲母胞蚴體內呈差異性上調表達的基因,還可能是影響母胞蚴生長發(fā)育的關鍵基因。本課題在此基礎上,對TAP蛋白在日本血吸蟲成蟲和母胞蚴體內的組織學分布進行了定位,并進一步研究其抗血吸蟲感染的免疫保護性作用,及其在釘螺頭足部組織浸出液共培養(yǎng)體系中對日本血吸蟲母胞蚴生長發(fā)育的調控作用及機制。方法:利用分子生物學方法,構建PET28a(+)-SjTAP重組表達質粒,大量誘導表達并純化重組TAP蛋白;以重組TAP蛋白免疫小鼠制備免疫血清。免疫熒光組織化學染色法檢測TAP在日本血吸蟲成蟲和母胞蚴體內的組織分布與定位;重組TAP蛋白定期免疫小鼠6周后血吸蟲尾蚴攻擊感染,42天后統(tǒng)計各組小鼠的蟲荷數(shù)和每克肝臟的蟲卵負荷,計算減蟲率與減卵率,評價SjTAP的免疫保護性效果。實時熒光定量PCR(real-timePCR)檢測與釘螺頭足部組織浸出液(protein extracts of O.hupensis head-foot tissue,PHF)共培養(yǎng)第1、3、4、8天母胞蚴TAP mRNA的表達水平;設計SjTAP特異性siRNA,浸泡法飼喂培養(yǎng)的日本血吸蟲母胞蚴,real-time PCR檢測RNAi干擾后母胞蚴體內TAP的表達水平,同時觀察和測量母胞蚴體長、體寬和體積等生長發(fā)育指標變化及其存活率;添加釘螺頭足部組織浸出液,RNAi干擾后,real-time PCR及免疫熒光組織化學染色法分別檢測各組母胞蚴體內TAP基因和蛋白的表達水平變化,并觀察和測量各組母胞蚴的生長發(fā)育變化及存活率情況。結果:成功構建了含774bpSjTAP的PET28a(+)-SjTAP重組表達質粒,獲得35kDaTAP重組表達蛋白。免疫熒光組織化學染色結果顯示TAP蛋白特異性紅色熒光顆粒廣泛分布于日本血吸蟲雌、雄成蟲的皮層、皮下層、肌層和實質層,其中,在雌蟲的皮層及卵巢周圍、雄蟲的皮層和皮下層,TAP熒光顆粒呈明顯線狀分布,在其它部位組織中則呈彌散性分布,僅局部組織有增強。重組TAP蛋白的免疫保護性實驗結果顯示:免疫組的減蟲率為39.9%,減卵率為71.8%;佐劑對照組減蟲率為10.8%,減卵率為59.7%;二者組間差異均具有顯著性(p0.05),表明TAP重組蛋白對血吸蟲感染具有一定的免疫保護性。Real-time PCR結果顯示:與對照組比較,與釘螺頭足部組織浸出液共培養(yǎng)組母胞蚴TAP基因mRNA的表達水平,從培養(yǎng)第3天開始顯著上升,在培養(yǎng)第3、4和8天分別上升6.64倍、2.64倍和6.27倍(p0.01)。免疫熒光組織化學染色結果顯示TAP蛋白主要表達在母胞蚴的體壁和胞質中。RNAi干擾實驗結果顯示,30nM的SjTAP siRNA即可顯著抑制母胞蚴TAP基因的表達,使其mRNA表達水平降低93.45%。干擾第6天,SjTAPsiRNA組(siTAP)母胞蚴體長、體寬、體積和存活率分別為 87.23±6.29μm、47.52±3.15μm、128276.36±26920.07μm3 和89.2%,與 siRNA 對照組(sictrl)蟲體體長 112.45±11.6μm、體寬 46.74±3.13μm、體積169004.73±40326.01μm3和98%存活率相比較,siTAP組母胞蚴體長明顯縮短、體積變小、存活率降低(p0.05)。添加釘螺頭足部組織浸出液后,實驗分為四組:sictrl、siRNA對照組+1%釘螺頭足部組織浸出液共培養(yǎng)組(sictrl+1%PHF)、siTAP、SjTAP、siRNA+1%釘螺頭足部組織浸出液共培養(yǎng)組(siTAP+l%PHF);在培養(yǎng)第6天,sictrl+l%PHF共培養(yǎng)組母胞蚴的TAP mRNA表達水平較sictrl組顯著升高(p0.05);以TAPsiRNA沉默TAP基因后,siTAP+l%PHF組母胞蚴的TAP mRNA表達水平與sictrl+l%PHF組母胞蚴比較明顯下降(p0.05);免疫熒光組織化學染色結果顯示四組母胞蚴體內TAP的熒光表達強度與其mRNA水平一致。光鏡下,在培養(yǎng)第6天,siTAP組母胞蚴與sictrl組比較,其體長、體寬、體積均均明顯減少,存活率顯著降低(p0.05);sictrl+l%PHF與 sictrl 組、sictrl+l%PHF 與 siTAP+l%PHF 組、siTAP+l%PHF 與 siTAP 組兩兩比較,前者母胞蚴的體長、體寬和體積等均值明顯較大(p0.05),蟲體存活率也較高(p0.05)。結論:成功構建了SjTAP的重組表達質粒,表達獲得了35KD的TAP重組蛋白。在日本血吸蟲成蟲體內,TAP蛋白主要表達于雌雄成蟲的皮層、皮下層、肌層和實質層,在皮層呈線性分布,其它部位呈彌散性分布;重組TAP蛋白具有一定的抗血吸蟲感染的免疫保護性作用。在日本血吸蟲母胞蚴體內,TAP蛋白主要表達于其體壁和胞質中,且隨培養(yǎng)時間的延長體壁上的表達量逐漸增加;TAP基因具有促進母胞蚴的生長發(fā)育和存活作用;與釘螺組織共培養(yǎng)體系中,釘螺頭足部組織浸出液是通過上調母胞蚴TAP基因的表達,進而發(fā)揮其促進母胞蚴生長發(fā)育與生存能力的作用。
【學位單位】：武漢大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R383.24
【部分圖文】：

圖４?ＰＥＴ２８ａ（＋）－沒７：４尸Ｍ：ＤＮＡ?Ｍａｒｋｅｒ?ＤＬ２０００；?１－Ｆｉｇ．４?Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ?ｏｆ?ｔｈｅ?ＴＡＭ：ＤＮＡ?Ｍａｒｋｅｒ?ＤＬ２０００；ｌａｎｅ?ｌ－１

隨機選�。保秱�ＢＬ２１單克隆菌株進行ＰＣＲ篩選（圖４）。結果顯示除第??９和１１號樣本外，其他樣本均在７７４ｂｐ位置出現(xiàn)目標條帶。將測序的基因序列??與ＴＩＰ的ＯＲＦ序列進行ＢＬＡＳＴ對比，結果如圖５。二者序列完全一致，表明??陽性克隆成功。??Ｍ?１?２??ＤＬ２０００ｂｐ?圖?３?Ｍ戶和?ＰＥＴ２８ａ（＋）雙酶切圖??Ｍ：ＤＮＡ?Ｍａｒｋｅｒ?ＤＬ２０００；??１：?Ｍ尸漢酶切片段；??２０００?２：?ＰＥＴ２８ｃｘ（＋）雙酶切片段??Ｆｉｇ．３?ＴＡＰ?ａｎｄ?ＰＥＴ２８ａ（＋）?ｄｉｇｅｓｔｅｄ?ｂｙ?ＢａｍＨＩａｎｄ?Ｍｉｎｄｌｌｌ??５００?Ｍ：ＤＮＡ?Ｍａｒｋｅｒ?ＤＬ２０００；??２５〇?１：?ＴＡＰ?ｄｉｇｅｓｔｅｄ?ｂｙ?ＢａｍＨ?Ｉ?ａｎｄ?Ｈｉｎｄｌｌｌ；??１００?２：?ＰＥＴ２８ａ（＋）?ｄｉｇｅｓｔｅｄ?ｂｙ?ＢａｍＨ?ｌａｎｄ?Ｈｉｎｄｌｌｌ??Ｍａｒｋｅｒ?１?２?３?４?５?６?７?８?９?１０?１１?１２?１３?１４?１５?１６??圖４?ＰＥＴ２８ａ

４．重組ＴＡＰ蛋白的誘導表達及鑒定??ＴＡＰ重組蛋白的小量誘導表達：重組菌液在３７°Ｃ、ＩｍＭ的ＩＰＴＧ中誘導表??達約４ｈ，?ＳＤＳ－ＰＡＧＥ檢測ＴＡＰ的表達量。結果見圖６，與未誘導菌液相比，加??入ＩＰＴＧ誘導后，在誘導全菌及細菌裂解液沉淀中都出現(xiàn)２５ｋＤａ、３５ｋＤａ特異性??蛋白條帶，而細菌裂解上清液中沒有出現(xiàn)相應條帶，推測ＴＡＰ重組蛋白不是分??泌型蛋白，不能分泌表達，而是以包涵體形式在細菌中表達。??ＴＡＰ重組蛋白的大量誘導表達及純化：在ＢＬ２１菌中大量誘導表達ＴＡＰ重組蛋??白，將菌體沉淀經超聲破碎處理后，獲得粗制包涵體，用組氨酸標簽磁珠對目的??蛋白進行純化，純化蛋白ＳＤＳ－ＰＡＧＥ膠鑒定結果如圖７所示，在預測３５ｋＤ處有重??組蛋白條帶。??重組ＴＡＰ蛋白的Ｗｅｓｔｅｒｎ?Ｂｌｏｔ鑒定：將經ＩＰＴＧ誘導后產生的蛋白純化后??進行免疫印跡鑒定，由圖７可知誘導后細菌表達重組目的蛋白，經純化后獲得較??好純度的重組目的蛋白。??ｋＤａ?Ｍ?１?２?３?４?ｋＤａ??圖６重組ＴＡＰ蛋白的小量誘導表達?圖７重組ＴＡＰ蛋白的大量誘導表達純化??Ｍ：?Ｐｒｏｔｅｉｎ?ｍａｒｋｅｒ；?Ｍ：?Ｐｒｏｔｅｉｎ?ｍａｒｋｅｒ；??丨：束誘導對照；?１：磁
【參考文獻】

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本文編號：2870846