目的:日本血吸蟲(chóng)酪氨酸3-/色氨酸5-單加氧酶激活蛋白基因(Schistosoma japonicum tyrosine 3-monooxygenase/tryptophan 5-monooxygenase activation protein,SjTAP),已知可能是具有抗血吸蟲(chóng)感染的免疫保護(hù)性基因;同時(shí),SjTAP是在與釘螺組織共培養(yǎng)日本血吸蟲(chóng)母胞蚴體內(nèi)呈差異性上調(diào)表達(dá)的基因,還可能是影響母胞蚴生長(zhǎng)發(fā)育的關(guān)鍵基因。本課題在此基礎(chǔ)上,對(duì)TAP蛋白在日本血吸蟲(chóng)成蟲(chóng)和母胞蚴體內(nèi)的組織學(xué)分布進(jìn)行了定位,并進(jìn)一步研究其抗血吸蟲(chóng)感染的免疫保護(hù)性作用,及其在釘螺頭足部組織浸出液共培養(yǎng)體系中對(duì)日本血吸蟲(chóng)母胞蚴生長(zhǎng)發(fā)育的調(diào)控作用及機(jī)制。方法:利用分子生物學(xué)方法,構(gòu)建PET28a(+)-SjTAP重組表達(dá)質(zhì)粒,大量誘導(dǎo)表達(dá)并純化重組TAP蛋白;以重組TAP蛋白免疫小鼠制備免疫血清。免疫熒光組織化學(xué)染色法檢測(cè)TAP在日本血吸蟲(chóng)成蟲(chóng)和母胞蚴體內(nèi)的組織分布與定位;重組TAP蛋白定期免疫小鼠6周后血吸蟲(chóng)尾蚴攻擊感染,42天后統(tǒng)計(jì)各組小鼠的蟲(chóng)荷數(shù)和每克肝臟的蟲(chóng)卵負(fù)荷,計(jì)算減蟲(chóng)率與減卵率,評(píng)價(jià)SjTAP的免疫保護(hù)性效果。實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-timePCR)檢測(cè)與釘螺頭足部組織浸出液(protein extracts of O.hupensis head-foot tissue,PHF)共培養(yǎng)第1、3、4、8天母胞蚴TAP mRNA的表達(dá)水平;設(shè)計(jì)SjTAP特異性siRNA,浸泡法飼喂培養(yǎng)的日本血吸蟲(chóng)母胞蚴,real-time PCR檢測(cè)RNAi干擾后母胞蚴體內(nèi)TAP的表達(dá)水平,同時(shí)觀察和測(cè)量母胞蚴體長(zhǎng)、體寬和體積等生長(zhǎng)發(fā)育指標(biāo)變化及其存活率;添加釘螺頭足部組織浸出液,RNAi干擾后,real-time PCR及免疫熒光組織化學(xué)染色法分別檢測(cè)各組母胞蚴體內(nèi)TAP基因和蛋白的表達(dá)水平變化,并觀察和測(cè)量各組母胞蚴的生長(zhǎng)發(fā)育變化及存活率情況。結(jié)果:成功構(gòu)建了含774bpSjTAP的PET28a(+)-SjTAP重組表達(dá)質(zhì)粒,獲得35kDaTAP重組表達(dá)蛋白。免疫熒光組織化學(xué)染色結(jié)果顯示TAP蛋白特異性紅色熒光顆粒廣泛分布于日本血吸蟲(chóng)雌、雄成蟲(chóng)的皮層、皮下層、肌層和實(shí)質(zhì)層,其中,在雌蟲(chóng)的皮層及卵巢周圍、雄蟲(chóng)的皮層和皮下層,TAP熒光顆粒呈明顯線狀分布,在其它部位組織中則呈彌散性分布,僅局部組織有增強(qiáng)。重組TAP蛋白的免疫保護(hù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:免疫組的減蟲(chóng)率為39.9%,減卵率為71.8%;佐劑對(duì)照組減蟲(chóng)率為10.8%,減卵率為59.7%;二者組間差異均具有顯著性(p0.05),表明TAP重組蛋白對(duì)血吸蟲(chóng)感染具有一定的免疫保護(hù)性。Real-time PCR結(jié)果顯示:與對(duì)照組比較,與釘螺頭足部組織浸出液共培養(yǎng)組母胞蚴TAP基因mRNA的表達(dá)水平,從培養(yǎng)第3天開(kāi)始顯著上升,在培養(yǎng)第3、4和8天分別上升6.64倍、2.64倍和6.27倍(p0.01)。免疫熒光組織化學(xué)染色結(jié)果顯示TAP蛋白主要表達(dá)在母胞蚴的體壁和胞質(zhì)中。RNAi干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,30nM的SjTAP siRNA即可顯著抑制母胞蚴TAP基因的表達(dá),使其mRNA表達(dá)水平降低93.45%。干擾第6天,SjTAPsiRNA組(siTAP)母胞蚴體長(zhǎng)、體寬、體積和存活率分別為 87.23±6.29μm、47.52±3.15μm、128276.36±26920.07μm3 和89.2%,與 siRNA 對(duì)照組(sictrl)蟲(chóng)體體長(zhǎng) 112.45±11.6μm、體寬 46.74±3.13μm、體積169004.73±40326.01μm3和98%存活率相比較,siTAP組母胞蚴體長(zhǎng)明顯縮短、體積變小、存活率降低(p0.05)。添加釘螺頭足部組織浸出液后,實(shí)驗(yàn)分為四組:sictrl、siRNA對(duì)照組+1%釘螺頭足部組織浸出液共培養(yǎng)組(sictrl+1%PHF)、siTAP、SjTAP、siRNA+1%釘螺頭足部組織浸出液共培養(yǎng)組(siTAP+l%PHF);在培養(yǎng)第6天,sictrl+l%PHF共培養(yǎng)組母胞蚴的TAP mRNA表達(dá)水平較sictrl組顯著升高(p0.05);以TAPsiRNA沉默TAP基因后,siTAP+l%PHF組母胞蚴的TAP mRNA表達(dá)水平與sictrl+l%PHF組母胞蚴比較明顯下降(p0.05);免疫熒光組織化學(xué)染色結(jié)果顯示四組母胞蚴體內(nèi)TAP的熒光表達(dá)強(qiáng)度與其mRNA水平一致。光鏡下,在培養(yǎng)第6天,siTAP組母胞蚴與sictrl組比較,其體長(zhǎng)、體寬、體積均均明顯減少,存活率顯著降低(p0.05);sictrl+l%PHF與 sictrl 組、sictrl+l%PHF 與 siTAP+l%PHF 組、siTAP+l%PHF 與 siTAP 組兩兩比較,前者母胞蚴的體長(zhǎng)、體寬和體積等均值明顯較大(p0.05),蟲(chóng)體存活率也較高(p0.05)。結(jié)論:成功構(gòu)建了SjTAP的重組表達(dá)質(zhì)粒,表達(dá)獲得了35KD的TAP重組蛋白。在日本血吸蟲(chóng)成蟲(chóng)體內(nèi),TAP蛋白主要表達(dá)于雌雄成蟲(chóng)的皮層、皮下層、肌層和實(shí)質(zhì)層,在皮層呈線性分布,其它部位呈彌散性分布;重組TAP蛋白具有一定的抗血吸蟲(chóng)感染的免疫保護(hù)性作用。在日本血吸蟲(chóng)母胞蚴體內(nèi),TAP蛋白主要表達(dá)于其體壁和胞質(zhì)中,且隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)體壁上的表達(dá)量逐漸增加;TAP基因具有促進(jìn)母胞蚴的生長(zhǎng)發(fā)育和存活作用;與釘螺組織共培養(yǎng)體系中,釘螺頭足部組織浸出液是通過(guò)上調(diào)母胞蚴TAP基因的表達(dá),進(jìn)而發(fā)揮其促進(jìn)母胞蚴生長(zhǎng)發(fā)育與生存能力的作用。
【學(xué)位單位】：武漢大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R383.24
【部分圖文】：

圖４?ＰＥＴ２８ａ（＋）－沒(méi)７：４尸Ｍ：ＤＮＡ?Ｍａｒｋｅｒ?ＤＬ２０００；?１－Ｆｉｇ．４?Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ?ｏｆ?ｔｈｅ?ＴＡＭ：ＤＮＡ?Ｍａｒｋｅｒ?ＤＬ２０００；ｌａｎｅ?ｌ－１

隨機(jī)選�。保秱�(gè)ＢＬ２１單克隆菌株進(jìn)行ＰＣＲ篩選（圖４）。結(jié)果顯示除第??９和１１號(hào)樣本外，其他樣本均在７７４ｂｐ位置出現(xiàn)目標(biāo)條帶。將測(cè)序的基因序列??與ＴＩＰ的ＯＲＦ序列進(jìn)行ＢＬＡＳＴ對(duì)比，結(jié)果如圖５。二者序列完全一致，表明??陽(yáng)性克隆成功。??Ｍ?１?２??ＤＬ２０００ｂｐ?圖?３?Ｍ戶和?ＰＥＴ２８ａ（＋）雙酶切圖??Ｍ：ＤＮＡ?Ｍａｒｋｅｒ?ＤＬ２０００；??１：?Ｍ尸漢酶切片段；??２０００?２：?ＰＥＴ２８ｃｘ（＋）雙酶切片段??Ｆｉｇ．３?ＴＡＰ?ａｎｄ?ＰＥＴ２８ａ（＋）?ｄｉｇｅｓｔｅｄ?ｂｙ?ＢａｍＨＩａｎｄ?Ｍｉｎｄｌｌｌ??５００?Ｍ：ＤＮＡ?Ｍａｒｋｅｒ?ＤＬ２０００；??２５〇?１：?ＴＡＰ?ｄｉｇｅｓｔｅｄ?ｂｙ?ＢａｍＨ?Ｉ?ａｎｄ?Ｈｉｎｄｌｌｌ；??１００?２：?ＰＥＴ２８ａ（＋）?ｄｉｇｅｓｔｅｄ?ｂｙ?ＢａｍＨ?ｌａｎｄ?Ｈｉｎｄｌｌｌ??Ｍａｒｋｅｒ?１?２?３?４?５?６?７?８?９?１０?１１?１２?１３?１４?１５?１６??圖４?ＰＥＴ２８ａ

４．重組ＴＡＰ蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及鑒定??ＴＡＰ重組蛋白的小量誘導(dǎo)表達(dá)：重組菌液在３７°Ｃ、ＩｍＭ的ＩＰＴＧ中誘導(dǎo)表??達(dá)約４ｈ，?ＳＤＳ－ＰＡＧＥ檢測(cè)ＴＡＰ的表達(dá)量。結(jié)果見(jiàn)圖６，與未誘導(dǎo)菌液相比，加??入ＩＰＴＧ誘導(dǎo)后，在誘導(dǎo)全菌及細(xì)菌裂解液沉淀中都出現(xiàn)２５ｋＤａ、３５ｋＤａ特異性??蛋白條帶，而細(xì)菌裂解上清液中沒(méi)有出現(xiàn)相應(yīng)條帶，推測(cè)ＴＡＰ重組蛋白不是分??泌型蛋白，不能分泌表達(dá)，而是以包涵體形式在細(xì)菌中表達(dá)。??ＴＡＰ重組蛋白的大量誘導(dǎo)表達(dá)及純化：在ＢＬ２１菌中大量誘導(dǎo)表達(dá)ＴＡＰ重組蛋??白，將菌體沉淀經(jīng)超聲破碎處理后，獲得粗制包涵體，用組氨酸標(biāo)簽磁珠對(duì)目的??蛋白進(jìn)行純化，純化蛋白ＳＤＳ－ＰＡＧＥ膠鑒定結(jié)果如圖７所示，在預(yù)測(cè)３５ｋＤ處有重??組蛋白條帶。??重組ＴＡＰ蛋白的Ｗｅｓｔｅｒｎ?Ｂｌｏｔ鑒定：將經(jīng)ＩＰＴＧ誘導(dǎo)后產(chǎn)生的蛋白純化后??進(jìn)行免疫印跡鑒定，由圖７可知誘導(dǎo)后細(xì)菌表達(dá)重組目的蛋白，經(jīng)純化后獲得較??好純度的重組目的蛋白。??ｋＤａ?Ｍ?１?２?３?４?ｋＤａ??圖６重組ＴＡＰ蛋白的小量誘導(dǎo)表達(dá)?圖７重組ＴＡＰ蛋白的大量誘導(dǎo)表達(dá)純化??Ｍ：?Ｐｒｏｔｅｉｎ?ｍａｒｋｅｒ；?Ｍ：?Ｐｒｏｔｅｉｎ?ｍａｒｋｅｒ；??丨：束誘導(dǎo)對(duì)照；?１：磁
【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2870846