目的國標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定清潔級和SPF級小鼠必須排除仙臺病毒(Sendai virus,SeV)。為了提升效率,簡化操作步驟,本研究建立了一種新型分子檢測方法——實時熒光重組酶等溫擴增技術(shù)(real-time RPA)用于檢測SeV。方法針對SeV融合蛋白編碼基因的保守序列,設(shè)計特異性擴增引物及探針并建立檢測方法,并評價該檢測方法的特異性、敏感性、穩(wěn)定性和可靠性。最后將該檢測方法和團標(biāo)PCR方法進行優(yōu)勢比較。結(jié)果該方法具有很好的特異性,與小鼠肝炎病毒等六種病原微生物無交叉反應(yīng)。其敏感性、穩(wěn)定性和可靠性均可,并能夠在25 min內(nèi)完成,遠遠快于PCR方法。結(jié)論本研究建立的SeV實時熒光RPA是一種操作簡單,高效直觀且特異性好的檢測方法。
【部分圖文】：

本研究評估實時熒光RPA的敏感性，使用10倍倍比稀釋SeV cDNA制備濃度梯度100 ng/μL到100 fg/μL，作為反應(yīng)的模板。實時熒光RPA反應(yīng)中，前四個梯度能隨著時間的推移有大量的熒光信號累積(圖2)。圖2 實時熒光RPA擴增中Se V稀釋梯度的熒光信號

實時熒光RPA擴增中Se V稀釋梯度的熒光信號

本研究PCR方法為團體標(biāo)準(zhǔn)中的方法，反應(yīng)模板濃度梯度100 ng/μL到100 fg/μL和實時熒光RPA模板濃度梯度相同。PCR產(chǎn)物電泳圖中，前四個泳道可見目標(biāo)條道(圖5)。因此，如圖2和圖5所示這兩種方法檢測下限一致。PCR反應(yīng)完成需要100 min，跑膠及拍照耗時30 min，總計130 min,而實時熒光RPA擴增和檢測信號是實時呈現(xiàn)，全程僅需25 min，通常在6～20 min之間即可觀察到結(jié)果，大大縮短了檢測時間。另外，比起PCR儀，實時熒光RPA檢測儀Genie II，更加小巧輕便且自帶電池，適合現(xiàn)場檢測。圖4 Se V實時熒光RPA方法的峰值時間
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