目的國(guó)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定清潔級(jí)和SPF級(jí)小鼠必須排除仙臺(tái)病毒(Sendai virus,SeV)。為了提升效率,簡(jiǎn)化操作步驟,本研究建立了一種新型分子檢測(cè)方法——實(shí)時(shí)熒光重組酶等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(real-time RPA)用于檢測(cè)SeV。方法針對(duì)SeV融合蛋白編碼基因的保守序列,設(shè)計(jì)特異性擴(kuò)增引物及探針并建立檢測(cè)方法,并評(píng)價(jià)該檢測(cè)方法的特異性、敏感性、穩(wěn)定性和可靠性。最后將該檢測(cè)方法和團(tuán)標(biāo)PCR方法進(jìn)行優(yōu)勢(shì)比較。結(jié)果該方法具有很好的特異性,與小鼠肝炎病毒等六種病原微生物無(wú)交叉反應(yīng)。其敏感性、穩(wěn)定性和可靠性均可,并能夠在25 min內(nèi)完成,遠(yuǎn)遠(yuǎn)快于PCR方法。結(jié)論本研究建立的SeV實(shí)時(shí)熒光RPA是一種操作簡(jiǎn)單,高效直觀且特異性好的檢測(cè)方法。
【部分圖文】：

本研究評(píng)估實(shí)時(shí)熒光RPA的敏感性，使用10倍倍比稀釋SeV cDNA制備濃度梯度100 ng/μL到100 fg/μL，作為反應(yīng)的模板。實(shí)時(shí)熒光RPA反應(yīng)中，前四個(gè)梯度能隨著時(shí)間的推移有大量的熒光信號(hào)累積(圖2)。圖2 實(shí)時(shí)熒光RPA擴(kuò)增中Se V稀釋梯度的熒光信號(hào)

實(shí)時(shí)熒光RPA擴(kuò)增中Se V稀釋梯度的熒光信號(hào)

本研究PCR方法為團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)中的方法，反應(yīng)模板濃度梯度100 ng/μL到100 fg/μL和實(shí)時(shí)熒光RPA模板濃度梯度相同。PCR產(chǎn)物電泳圖中，前四個(gè)泳道可見(jiàn)目標(biāo)條道(圖5)。因此，如圖2和圖5所示這兩種方法檢測(cè)下限一致。PCR反應(yīng)完成需要100 min，跑膠及拍照耗時(shí)30 min，總計(jì)130 min,而實(shí)時(shí)熒光RPA擴(kuò)增和檢測(cè)信號(hào)是實(shí)時(shí)呈現(xiàn)，全程僅需25 min，通常在6～20 min之間即可觀察到結(jié)果，大大縮短了檢測(cè)時(shí)間。另外，比起PCR儀，實(shí)時(shí)熒光RPA檢測(cè)儀Genie II，更加小巧輕便且自帶電池，適合現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。圖4 Se V實(shí)時(shí)熒光RPA方法的峰值時(shí)間
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