研究背景:生殖支原體(Mycoplasma genitalium,Mg)是一類缺乏細(xì)胞壁、能在無生命培養(yǎng)基中生長繁殖的最小原核細(xì)胞型微生物。其主要黏附蛋白MgPa(M.genitalium protein of adhesion,MgPa)是Mg黏附并入侵宿主細(xì)胞的關(guān)鍵因素。Mg可經(jīng)MgPa與宿主細(xì)胞發(fā)生相互作用,然而國內(nèi)外尚未見關(guān)于MgPa互作蛋白研究的報(bào)道,且對MgPa生物學(xué)功能研究較少。支原體與宿主細(xì)胞間的相互作用是支原體致病的關(guān)鍵。本研究通過噬菌體展示技術(shù)從人尿道上皮細(xì)胞(SV-HUC-1)T7噬菌體展示cDNA文庫中篩選與鑒定與MgPa相互作用的蛋白,并通過串聯(lián)質(zhì)譜標(biāo)簽(Tandem Mass Tags,TMT)標(biāo)記的蛋白定量法研究發(fā)生互作后差異蛋白的表達(dá),為了解MgPa的功能,進(jìn)一步研究Mg的致病機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。研究目的:從人尿道上皮細(xì)胞(SV-HUC-1)T7噬菌體展示cDNA文庫篩選與鑒定Mg黏附蛋白MgPa的互作蛋白,進(jìn)一步研究互作后對細(xì)胞功能的影響,為深入了解MgPa的生物學(xué)功能以及Mg的致病機(jī)制奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。研究方法:(1)SV-HUC-1 T7噬菌體cDNA初始文庫的擴(kuò)增。(2)SV-HUC-1 T7噬菌體cDNA文庫與MgPa互作蛋白的親和篩選、PCR擴(kuò)增、DNA測序與BLAST分析。(3)間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)、斑點(diǎn)免疫印跡驗(yàn)證陽性噬菌體與rMgPa的特異結(jié)合。(4)Far-western blot檢測RPL35與rMgPa的特異結(jié)合。(5)構(gòu)建MgPa真核表達(dá)載體,通過間接免疫熒光鑒定RPL35和MgPa在細(xì)胞內(nèi)的互作。(6)TMT法篩選pcDNA3.1(+)/MgPa轉(zhuǎn)染前后的差異蛋白。(7)實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測pcDNA3.1(+)/MgPa轉(zhuǎn)染前后表皮生長因子(EGF)、真核翻譯起始因子(EIF2)、信號識別顆粒因子(SRP68)、纖溶酶原激活物抑制物1 RNA結(jié)合蛋白(SERBP1)、核糖體蛋白(RPL35A)和轉(zhuǎn)化生長因子(TGF-β1)mRNA表達(dá)水平,并通過MTT法檢測轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的增殖情況。研究結(jié)果:(1)SV-HUC-1 T7噬菌體cDNA初始文庫擴(kuò)增后滴度為3x10~8pfu。(2)經(jīng)過4輪的生物淘選,噬菌體產(chǎn)率從第一輪篩選的0.67×10~(-4)到第4輪篩選的1.7×10~(-3),表明與rMgPa特異結(jié)合的噬菌體明顯得到富集。(3)PCR擴(kuò)增陽性噬菌體,送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序,經(jīng)BLAST比對分析,結(jié)果表明隨機(jī)挑取的32個陽性克隆包括7種不同序列,即代表7種不同的蛋白,將7種序列分別用P1至P7進(jìn)行編號,其中以RPL35重復(fù)次數(shù)最多,其重復(fù)率達(dá)62.5%。(4)間接ELISA法檢測代表性噬菌體與rMgPa的結(jié)合情況,結(jié)果表明7種噬菌體均能與rMgPa特異結(jié)合,其中P1(RPL35)、P2(Mitochondrio complete genome)和P3(RPN4)與MgPa結(jié)合力較強(qiáng)。(5)用斑點(diǎn)免疫印跡法進(jìn)一步檢測陽性噬菌體能否與rMgPa特異結(jié)合,結(jié)果表明P1、P2和P3代表性噬菌體出現(xiàn)了明顯的斑點(diǎn),說明P1、P2和P3能與rMgPa特異結(jié)合,與間接ELISA法結(jié)果一致。(6)Far-western blot方法進(jìn)一步檢測SV-HUC-1細(xì)胞總蛋白中RPL35與rMg Pa的結(jié)合情況,結(jié)果顯示在約37 KDa處出現(xiàn)明顯條帶,說明細(xì)胞總蛋白中的RPL35能與rMgPa特異結(jié)合。(7)以MgPa基因序列(3223~4092,870bp),構(gòu)建pcDNA3.1(+)/MgPa真核表達(dá)載體,通過雙酶切和PCR鑒定證實(shí)MgPa真核表達(dá)載體構(gòu)建成功。(8)用間接免疫熒光法(IF)檢測Mg是否能侵入SV-HUC-1細(xì)胞,結(jié)果表明Mg能入侵宿主細(xì)胞內(nèi)。(9)將pcDNA3.1(+)/MgPa轉(zhuǎn)染至SV-HUC-1細(xì)胞,SDS-PAGE和Western blot的結(jié)果表明真核表達(dá)載體在細(xì)胞中轉(zhuǎn)染成功。(10)間接免疫熒光試驗(yàn)的結(jié)果說明pcDNA3.1(+)/MgPa轉(zhuǎn)染成功且RPL35與MgPa在SV-HUC-1中能共定位,表明RPL35與MgPa能在細(xì)胞內(nèi)相互作用。(11)TMT蛋白定量法結(jié)果表明:與正常組相比,pcDNA3.1(+)/MgPa轉(zhuǎn)染24h組有401個蛋白上調(diào),6個蛋白下調(diào)。(12)實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)的結(jié)果表明:與正常組相比,pcDNA3.1(+)/MgPa轉(zhuǎn)染組EGF、EIF2、SRP68、SERBP、RPL35A和TGF-β1出現(xiàn)不同程度的增高。(13)MTT法檢測轉(zhuǎn)染后24h至48h細(xì)胞出現(xiàn)增殖,72h后細(xì)胞增殖受到抑制。結(jié)論:(1)60S核糖體蛋白L35(RPL35)可能是MgPa的互作蛋白。(2)MgPa與RPL35互作可上調(diào)細(xì)胞轉(zhuǎn)錄起始與翻譯相關(guān)蛋白的表達(dá),促進(jìn)細(xì)胞增殖。
【學(xué)位單位】：南華大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R375
【部分圖文】：

第 4 章 實(shí)驗(yàn)結(jié)果第 4 章 實(shí)驗(yàn)結(jié)果C-1 T7 噬菌體展示 cDNA 文庫得到擴(kuò)增前期構(gòu)建的SV-HUC-1 T7噬菌體展示cDNA文庫在宿主菌菌體文庫稀釋成不同的倍數(shù)，在含羧芐青霉素的 L 37℃溫箱培養(yǎng)過夜，計(jì)算擴(kuò)增后的滴度為 3×108pfu，結(jié)增的噬菌體文庫具有較高的滴度。102104

表 2.1 親和篩選噬菌體的投入量、產(chǎn)出量及其比值Tab 2. 1 Theinput, output of phages and ratio for affinity screening4.2.2 PCR 擴(kuò)增噬菌體的外源基因?yàn)閿U(kuò)增噬菌體含有的外源基因，對從第 4 輪篩選的平板上隨機(jī)挑取的 32 個噬菌斑進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，PCR 產(chǎn)物采用 1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析，結(jié)果顯示成功提取到 32 個噬菌體的外源 DNA，其片段大小介于 250bp~750bp 之間，且 500bp左右的克隆最多，結(jié)果如圖 2.2 所示。篩選次數(shù)1 2 3 4投入量(pfu)3×1083×1083×1083×108產(chǎn)出量(pfu)2×1044.2×1041.9×1055×105投入/產(chǎn)出 0.67×10-41.4×10-46.3×10-41.7×10-3

圖 3.1 ELISA 檢測噬菌體與 rMgPa 的特異結(jié)合Fig 3.1 The specific combination between representative phages and rMgPa were detecELISA .Note: P1-P7: number of representative phages; WT: Wild type phage. BSA was used as blank control. The indicates p<0.01 compared with the BSAgroup, * indicatep<0.05 compared with the BSAgroup.4.3.2 斑點(diǎn)免疫印跡檢測陽性噬菌體與 rMgPa 的特異結(jié)合采用斑點(diǎn)免疫印跡法進(jìn)一步檢測 7 個代表性噬菌體能否與 rMgPa 特異結(jié)結(jié)果如圖 3.2 所示：P1、P2 和 P3 代表性噬菌體出現(xiàn)了明顯的斑點(diǎn)，說明 P（RPL-35）、P2（Mitochondrio complete genome）和 P3（RPN4）能與 rM特異結(jié)合，該結(jié)果與上述 ELISA 的結(jié)果一致。
【參考文獻(xiàn)】

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1 朱有蔥;何軍;游曉星;朱翠明;李冉輝;曾焱華;;人尿道上皮細(xì)胞T7噬菌體展示cDNA文庫的構(gòu)建與鑒定[J];生物技術(shù);2015年02期

2 曾焱華;鄧仲良;余堅(jiān);朱翠明;余敏君;張紅;;生殖支原體黏附素蛋白模擬表位的篩選和鑒定[J];實(shí)用預(yù)防醫(yī)學(xué);2012年12期

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本文編號：2861719