目的探討改良的聯(lián)合酶消化法對于瘢痕疙瘩真皮組織的消化效果,并探究最佳消化時間。方法收集瘢痕疙瘩樣本8例,去除表皮后用剪刀將真皮組織勻漿。真皮勻漿采用A、B兩種方案進行消化。A方案采用傳統(tǒng)的聯(lián)合酶消化法(Ⅰ型膠原酶+Ⅱ型膠原酶+Ⅳ型膠原酶+透明質(zhì)酸酶);B方案采用改良聯(lián)合酶消化法,在A方案的基礎(chǔ)上添加了DNaseⅠ。采用顯微鏡計數(shù)單細胞占比和單細胞數(shù),臺盼藍染色和流式細胞檢測細胞活性,比較A、B兩種消化方案的消化效率,同時探究B方案的最佳消化時間。結(jié)果消化2 h和4 h后,B方案相比A方案獲得的單細胞比例顯著升高(P0.05),單細胞數(shù)顯著增多(P0.01)。應(yīng)用B方案,消化時間延長至6 h,相比消化4 h得到的單細胞比例和單細胞數(shù)顯著增加(P0.05),細胞活性無明顯改變(P0.05)。消化時間延長至8 h和10 h,與6 h相比,單細胞比例和單細胞數(shù)無明顯增加(P0.05),細胞活性顯著下降(P0.05)。結(jié)論在傳統(tǒng)聯(lián)合酶消化液中添加DNaseⅠ能夠提高消化效率,有效制備疤痕疙瘩組織的單細胞懸液。組織消化6 h能夠在保持細胞活性的同時達到較好的消化效果。
【部分圖文】：

Masson染色顯示瘢痕疙瘩組織最為特征性的改變是真皮深層細胞增生活躍、膠原高度沉積的增生結(jié)節(jié)區(qū)，該區(qū)膠原纖維排列紊亂，形成粗大的纖維條索和結(jié)節(jié)。這提示在制備單細胞懸液的過程中，需要大量降解膠原成分的酶，以釋放包裹于致密細胞外基質(zhì)中的細胞（圖1）。2.2 A組和B組消化效率的比較

目前，皮膚組織的消化沒有固定的方案，最為常用的是酶消化法。中性蛋白酶能有效降解細胞和細胞外基質(zhì)間的連接蛋白，對細胞間連接和細胞本身幾乎不造成影響，故常被用于表皮和真皮的分離[14]。膠原是真皮組織中主要的細胞外基質(zhì)成分。因此，真皮組織的消化主要依賴各種類型的膠原酶。其中，有采用單一類型的膠原酶（如Ⅰ型膠原酶[10]或Ⅳ型膠原酶[11]）對瘢痕疙瘩組織進行消化，也有使用粗制的混合膠原酶[12]（包含Ⅰ型、Ⅱ型膠原酶等）進行消化。但是，由于其目的在于提取成纖維細胞，因而在單細胞比例上沒有明確要求，消化得到的細胞懸液中包含大量細胞團塊，無法達到單細胞懸液的制備要求。近年來，隨著單細胞檢測技術(shù)的興起，人們對真皮組織的消化程度提出了更高的要求。相繼有研究報道了正常皮膚單細胞懸液的制備方法，能夠滿足常規(guī)流式細胞檢測和單細胞測序的要求[4-6,13]。其中主要的消化方式分為兩種：一種是皮膚消化試劑盒（Whole skin dissociation kit）和配套的組織消化儀（gentleMACS Dissociator)[4-5]，另一種是聯(lián)合酶消化法[6,13]。由于條件限制，本研究并未購置組織消化儀，因此主要討論聯(lián)合酶消化法及其改進方案。聯(lián)合酶消化法采用混合酶溶液（1.25 mg/mLⅠ型膠原酶、0.5 mg/mLⅡ型膠原酶、0.5 mg/mLⅣ型膠原酶和0.1 mg/mL透明質(zhì)酸酶）在37℃消化真皮組織1 h，可以將組織有效消化，消化后的細胞表面抗原，如成纖維細胞抗原CD90、FAP、CD36等保存良好，能夠進行后續(xù)的流式細胞檢測和原代細胞培養(yǎng)[6]。但是，該方案在消化瘢痕疙瘩時顯得效率不足，預(yù)實驗結(jié)果顯示，經(jīng)過1 h的消化，細胞懸液中仍有大量聚集的細胞團，提示消化不完全。為了獲得更好的消化效果，必須對聯(lián)合酶消化法進行改進。圖3 B組消化4 h、6 h、8 h和10 h的組織消化效果

B組消化4 h、6 h、8 h和10 h的組織消化效果
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本文編號：2856697